Xác định đồng thời aspartame và saccharin trong một số loại đồ uống bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học - Tập 25, Số 2/2020 
XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ASPARTAME VÀ SACCHARIN TRONG MỘT SỐ 
LOẠI ĐỒ UỐNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 
Đến tòa soạn 2-12-2019 
Dương Thị Tú Anh 
Khoa Hóa học-Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên 
Phạm Thanh Tùng 
Trường THPT Cửa Ông, Thành phố Cẩm Phả, Tỉnh Quảng Ninh 
Đoàn Mạnh Cường 
Khoa Công nghệ điện tử & Truyền thông- Trường ĐHCN TT &TT- Đại học Thái Nguyên 
SUMMARRY 
SIMULTANEOUS IDENTIFICATION OF ASPARTAME AND SACCHARIN 
IN SOME DAILY BEVERAGES BY USING HIGH PERFORMANCE 
LIQUID CHROMATOGRAPHY METHOD 
In this research, we reported some results of simultaneous identification of aspartame and saccharin by 
using High Performance Liquid Chromatography method (HPLC) and simultaneous identification the 
content of aspartame and saccharin in some beverages by using HPLC. It is shown that, detection limit 
and quantitative limit by HPLC for aspartame was 0,2 ppm and 0,667 ppm; for Saccharin was 0,03 
ppm and 0,1 ppm; the linear concentration of aspartame ranged from 0,5 to 100 ppm, with a coefficient 
R2 is 0,9997; while the linear concentration of saccharin was in a range of 0,1 to 200 ppm with the 
same coefficient as aspartame. The content of aspartame and saccharin in analytical samples 
fluctuated from 6,931 to 19,06 ppm and from 41,70 to 79,69ppm. The recovery of aspartame and 
saccharin in analytical samples fluctuated from 90,14 to 98,75% and from 90,45 to 99,15 %. 
1. MỞ ĐẦU 
Asparame (ASP) là chất ngọt rất được ưa 
chuộng. ASP cũng không ổn định trong các 
dung dịch nước và dần dần chuyển thành 
diketopiperazine (DKP). Ngay sau khi được 
con người tiêu thụ, ASP phân hủy thành 3 hợp 
chất hóa học: phenylalanine (khoảng 50% 
trọng lượng), aspartic acid (40%), và methanol 
(10%). Những chất này có thể tồn tại trong 
gan, thận và não trong một thời gian khá dài. 
Các tác dụng phụ thường gặp khi sử dụng ASP 
bao gồm đau đầu, đau nửa đầu, rối loạn tâm lý, 
chóng mặt và xuất hiện các cơn hưng cảm. 
Saccharin (SCR) là một chất phụ gia tạo ngọt 
nhân tạo, nó được sử dụng để làm ngọt các sản 
phẩm như đồ uống giải khát, kẹo, bánh bích 
quy, thuốc chữa bệnh, kem đánh răng; là chất 
làm ngọt chính trong các loại thuốc dùng cho 
trẻ em, bao gồm aspirin nhai, xi-rô ho, các loại 
thuốc kê đơn và không kê đơn khác, ngoài 
ra nó còn được sử dụng trong cả những sản 
phẩm mỹ phẩm, vitamin và dược phẩm. Sử 
dụng SCR làm xuất hiện chứng nhạy cảm ánh 
sáng, buồn nôn, rối loạn tiêu hóa, nhịp tim 
nhanh và một số loại ung thư. Tuy nhiên tất cả 
những biến chứng do việc sử dụng SCR vẫn 
còn là một tranh cãi và chưa có kết luận nào 
thực sự có tính thuyết phục. 
Việc sử dụng ASP và SCR quá liều lượng hoặc 
không đúng cách sẽ gây ảnh hưởng lớn tới sức 
khỏe con người. Chính bởi vậy, việc kiểm soát 
hàm lượng ASP và SCR trong các mẫu thực 
207
phẩm nói chung cũng như mẫu đồ uống nói riêng 
là rất cần thiết. Có rất nhiều phương pháp phân 
tích đã được nghiên cứu và áp dụng để xác định 
hàm lượng ASP và SCR trong thực phẩm như 
phương pháp trắc quang, phương pháp chuẩn độ 
thể tích, phương pháp điện di mao quản, phương 
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [1- 6]. Trong bài 
báo này, chúng tôi thông báo kết quả xác định 
đồng thời ASP và SCR trong một số loại đồ uống 
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. 
2. THỰC NGHIỆM 
2.1. Thiết bị và hóa chất 
Thiết bị 
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC - hãng 
Shimadzu (Nhật bản) kết nối máy tính, Detector 
DAD, cột C18 (250 mm x 4,6 mm x 5µm); bể rung 
siêu âm (wise clean): Daihan, Máy ly tâm: HermLe, 
Z300 WUC-A10H; Cân phân tích Scientech SA 
210 độ chính xác 0,0001g; Máy đồng nhất mẫu: 
IKA, T25 BASIC ULTRA-TURRAX; Máy đo pH 
và các dụng cụ thủy tinh khác. 
Hóa chất 
Chất chuẩn gốc riêng rẽ thuộc hãng Sigma: 
SCR 99,95%, ASP 99,85%. 
Các hóa chất khác: K4[Fe(CN)6].3H2O (merk), 
ZnSO4.7H2O (merk), NaH2PO4 (merk), H3PO4 
(merk), Acetonitril (merk), Methanol 
(MeOH,merck) 
Dung môi pha mẫu: dung dịch đệm photphat 
(pH =4,5): dung dịch axetonitril (ACN) tỉ lệ 
90:10 về thể tích. 
2.2. Quá trình phân tích 
Lấy 5 ÷ 10 mL mẫu lỏng vào ống ly tâm; thêm 
5mL MeOH, lắc đều trên máy lắc votex, thêm 
30 mL nước cất, rung siêu âm 30 phút. Sau đó, 
chuyển toàn bộ lượng mẫu vào bình định mức 
100 mL, thêm 2 mL dung dịch carrez 1 (15g 
K4[Fe(CN)6].3H2O trong 100 mL nước cất), 
lắc đều, tiếp tục thêm 2 mL dung dịch carrez 2 
(30g ZnSO4.7H2O trong 100 mL nước cất), lắc 
đều, định mức đến vạch bằng nước cất 2 lần rồi 
lọc qua giấy lọc băng xanh. Dung dịch thu 
được tiếp tục được lọc qua màng lọc whatman 
0,45 µm và định lượng bằng phương pháp 
HPLC với detector DAD ở bước sóng 210nm, 
dựa vào thời gian lưu, diện tích pic để định tính 
và định lượng chất phân tích. 
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
3.1. Khảo sát các điều kiện phân tích 
3.1.1. Lựa chọn detector và xác định bước 
sóng hấp thụ cực đại 
Detector là một bộ phận quan trọng quyết định 
độ nhạy của phương pháp. SCR và ASP có khả 
năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại rất 
tốt do trong cấu tạo phân tử của các chất phân 
tích này đều có liên kết π . Vì vậy, detector 
DAD và detector UV đều có thể được sử dụng 
cho việc định tính và định lượng SCR và ASP, 
song detector DAD cho phép đo đồng thời tại 
nhiều bước sóng (đo phổ UV) trong quá trình 
sắc ký. Để thuận lợi cho quá trình phân tích 
chúng tôi lựa chọn detector DAD khi thực hiện 
các nghiên cứu tiếp theo. 
Xác định bước sóng hấp thụ cực đại của SCR 
và ASP: sử dụng detector DAD để quét tìm, 
với khoảng quét phổ là 190 ÷ 400 nm. Nồng độ 
của SCR và ASP là 10 ppm. Hình ảnh quét phổ 
của SCR và ASP thể hiện ở hình 1. 
Hình 1. Sắc ký đồ của của SCR và ASP 
208
Kết quả quét phổ cho thấy píc của sacchrin và 
ASP lần lượt tách ra ở các thời gian lưu là 6,48 
phút và 27,5 phút ở bước sóng 210 nm. Vì vậy 
chúng tôi lựa chọn bước sóng 210 nm để xác 
định đồng thời SCR và ASP. 
3.1.2. Lựa chọn cột tách 
Cột tách của hệ thống HPLC quyết định quá 
trình tách có độ phân giải tốt hay không. Căn 
cứ vào cấu trúc phân tử và độ phân cực của 
chất phân tích để lựa chọn cột tách phù hợp. 
Do cấu trúc phân tử SCR, ASP là chất phân 
cực yếu. Vì vậy, để tách được các chất này nên 
chọn pha tĩnh là pha ngược. Mặt khác, sử dụng 
chất nhồi pha ngược thì hệ dung môi là những 
chất phân cực nên kinh tế hơn, ổn định và 
không phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ, độ ẩm 
như chất nhồi của pha thường. Sắc đồ hỗn hợp 
các chất được phân tích bằng cột C18 
(250mm×4,6mm× 5μm) được thể hiện ở hình 
2. 
Hình 2. Sắc đồ phân tích SCR và ASP bằng cột C18 
3.1.3. Lựa chọn pha động 
Để tách ASP và SCR ra khỏi các chất cản trở 
trong nền mẫu và định lượng nó dễ dàng và 
chính xác, pha động sử dụng phải phân cực. 
Qua tham khảo các tài liệu [1-6], chúng tôi 
chọn lựa pha động là hỗn hợp NaH2PO4 và 
ACN, chế độ chạy sắc ký pha động thành phần 
không đổi (isocratic) với các tỷ lệ khác nhau 
của thành phần pha động. Kết quả cho thấy với 
thành phần pha động NaH2PO4 : ACN = 90 : 
10 (v/v) tại bước sóng 210nm, sắc đồ của SCR 
và ASP rõ nét và pic cân đối nhất. 
Hình 3. Sắc đồ phân tích SCR và ASP với thành phần pha động NaH2PO4 : ACN = 90 : 10 (v/v) 
3.1.4. Khảo sát pH của pha động 
Nếu pH của pha động cao, ASP sẽ bị phân hủy, 
pH của pha động chỉ nên trong khoảng 2-7, vì 
lớn hơn 7 hay nhỏ hơn 2 sẽ làm tăng độ tan của 
các hạt silic trên pha tĩnh. pH tốt nhất để tách 
các chất phân tích này là vùng axit vì ở vùng 
pH này, các chất phân tích tồn tại ở dạng aitx 
nên hấp phụ trên pha tĩnh tốt hơn. Tiến hành 
khảo sát các giá trị pH khác nhau của dung 
dịch NaH2PO4 (pH = 3; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0), tỷ lệ 
209
dung môi pha động là NaH2PO4 : ACN = 90 : 
10 (v/v), tốc dộ dòng là 1 mL/phút, thể tích 
bơm mẫu 10 µL, chất chuẩn hỗn hợp có nồng 
độ 10 ppm. Kết quả phân tích cho thấy ở pH = 
4,5, diện tích pic của SCR và ASP cao hơn, pic 
nhọn và cân đối hơn so với các giá trị pH khác. 
Vì vậy chúng tôi chọn pH của dung dịch đệm 
NaH2PO4 là 4,5 để thực hiện các nghiên cứu 
tiếp theo. 
3.1.5. Độ đặc hiệu, chọn lọc 
Để xác định tính chọn lọc, chúng tôi tiến hành 
phân tích các mẫu trắng và mẫu trắng có thêm 
chất chuẩn, so sánh mẫu trắng và mẫu trắng có 
thêm chuẩn SCR và ASP với nồng độ 10ppm. 
Kết quả thu được ở hình 4. 
(A) 
(B) 
Hình 4: Sắc ký đồ của mẫu trắng (A) và mẫu trắng có thêm chuẩn (B) 
Trên sắc đồ mẫu trắng không xuất hiện pic tại 
các thời gian lưu của SCR và aspartam. Còn 
trên sắc đồ mẫu thêm chuẩn có xuất hiện các 
pic tại các thời gian lưu tương ứng của SCR và 
aspartam. Như vậy phương pháp có tính đặc 
hiệu và chọn lọc đáp ứng yêu cầu phân tích. 
3.1.6. Khoảng tuyến tính 
Với các điều kiện chạy HPLC đã chọn, chúng 
tôi tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính 
của diện tích pic sắc ký vào nồng độ của SCR 
trong khoảng 0,1 ÷ 200 ppm và ASP trong 
khoảng 0,5 ÷100pm. Kết quả phân tích được 
chỉ ra trong bảng 1 và hình 5, 6. Kết quả phân 
tích cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát có 
sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic sắc 
ký và nồng độ của các chất phân tích. 
Bảng 1. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ 
tuyến tính của SCR và ASP 
SCR ASP 
Nồng 
độ 
(ppm) 
Diện tích 
pic 
(mAuxphút) 
Nồng độ 
(ppm) 
Diện tích 
pic 
(mAuxphút) 
0,1 6374 0,5 22,658 
0,2 12090 1,0 59,130 
0,5 31527 2,0 302,98 
1,0 58227 5,0 588,96 
2,0 117000 10,0 906,35 
5,0 305013 20,0 1231,34 
10,0 627550 50,0 2328,79 
20,0 1326120 100,0 3552,07 
50,0 3119078 y = 15056x + 27,433 
100,0 6129352 
R2= 0,9997 
200,0 12685692 
y = 63062x - 9149,5 
R2= 0,9997 
210
Hình 5. Đường chuẩn của SCR trong khoảng nồng 
độ 0,1 ÷ 200 ppm 
Hình 6. Đường chuẩn của ASP trong khoảng 
nồng độ 0,5 ÷ 100 ppm 
3.2. Kết quả phân tích một số mẫu thực 
Bảng 2. Mẫu, địa điểm, thời gian lấy mẫu 
STT Tên mẫu Ký hiệu mẫu Địa điểm lấy mẫu Thời gian lấy mẫu 
1 Nước ngọt có ga 1 M1 
Thành phố Hạ long, 
Tỉnh Quảng Ninh 
Tháng 7 năm 2019 
2 Nước tăng lực 1 M2 
3 Nước ngọt có ga 2 M3 
4 Nước khoáng vị chanh M4 
5 Trà sữa đóng chai M5 
Tháng 8 năm 2019 
6 Nước giải khát vị hoa quả 1 M6 
7 Nước tăng lực 2 M7 
8 Nước giải khát vị hoa quả 2 M8 
9 Nước tăng lực 3 M9 
Mẫu phân tích được lấy trực tiếp từ các mẫu đồ 
uống đóng chai hoặc đóng lon của nhà sản xuất. 
Việc xử lý và phân tích mẫu được thực hiện như 
quá trình phân tích được trình bày ở mục 2.2 và 
các điều kiện tối ưu đã khảo sát, lựa chọn. Mỗi 
mẫu phân tích được lặp lại 5 lần, sau đó lấy kết 
quả trung bình và xác định độ lệch chuẩn tương 
đối (%RSD) của phép xác định. Kết quả phân 
tích được chỉ ra trên bảng 3. 
Bảng 3. Kết quả phân tích lặp lại hàm lượng SCR và ASP trong mẫu thực 
Mẫu 
SCR ASP 
Hàm lượng 
(ppm) SD %RSD 
Hàm lượng 
(ppm) SD %RSD 
M1 79,69 0,98 1,245 18,96 0,397 2,094 
M2 62,68 0,75 1,198 14,36 0,357 2,486 
M3 51,63 0, 625 1,21 43,79 0,405 0,925 
M4 42,17 0,322 0,734 6,431 0,081 1,259 
M5 78,89 0,497 0,63 19,06 0,297 1,558 
211
M6 41,70 0,435 1,043 6,045 1,159 1,917 
M7 51,13 0,845 1,653 11,42 0.248 2,172 
M8 77,66 0,283 0,364 17,93 0,171 0,954 
M9 64,63 0,435 0,673 15,03 0,292 1,943 
Kết quả xác định SCR và ASP ở bảng 3 cho 
thấy trong các mẫu phân tích đều có chứa SCR 
và ASP với hàm lượng dao động trong khoảng 
41,70 ÷ 79,69 ppm đối với SCR và 6,045 ÷ 
43,79 ppm đối với ASP. Các giá trị này đều 
nằm dưới giới hạn cho phép của SCR và ASP 
theo TCVN 2015 [6]. Kết quả phân tích cũng 
cho thấy độ lệch chuẩn tương đối (%RSD) của 
SCR và ASP trong các mẫu phân tích đều nhỏ 
hơn 3%, điều đó chứng tỏ phép phân tích có độ 
lặp tốt. 
Để xác định độ đúng của phương pháp, chúng 
tôi tiến hành xác định độ thu hồi bằng cách 
thêm chuẩn 4mL ASP 113,5ppm và 4mL SCR 
208,38ppm vào 10mL dung dịch mẫu phân 
tích, định mức đến cùng thể tích và tiến hành 
chạy sắc ký đồ trong các điều kiện thí nghiệm 
đã lựa chọn, mỗi mẫu phân tích lặp lại 3 lần. 
Kết quả phân tích được chỉ ra trên bảng 4. 
Bảng 4. Kết quả xác định độ thu hồi của SCR và ASP 
Mẫu M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 
Cc(ppm) 
(SAC) 
83,35 83,35 83,35 83,35 83,35 83,35 83,35 83,35 83,35 
Cm(ppm) 
(SAC) 
79,69 62,68 51,63 42,17 78,89 41,70 51,13 77,66 64,63 
Cm+c(ppm) 
(SAC) 
161,77 143,95 127,95 124,33 154,28 120,52 132,52 160,09 146,18 
% Rev 98,48 97,50 91,56 98,57 90,45 94,56 98,85 99,15 97,84 
Cc(ppm) 
(ASP) 
45,40 45,40 45,40 45,40 45,40 45,40 45,40 45,40 45,40 
Cm(ppm) 
(ASP) 
18,96 14,36 43,79 6,43 19,06 6,05 11,42 17,93 15,03 
Cm+c(ppm) 
(ASP) 
62,77 59,19 86,55 48,00 59,98 50,01 53,21 62,35 57,90 
% ReV 96,5 98,75 94,18 91,58 90,14 96,84 91,85 97,85 94,43 
Từ các kết quả phân tích cho thấy độ thu hồi 
của phương pháp phân tích đối với các mãu 
phân tích đềulớn hơn 90%. Điều đó chứng tỏ 
phương pháp có độ đúng tốt. 
4. KẾT LUẬN 
Đã khảo sát và lựa chọn được điều kiện tối ưu 
cho phép xác định SCR và ASP bằng phương 
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao; Các kết quả 
xác định đồng thời SCR và ASP trong 09 mẫu 
có sai số đối với ASP ≤2,486%, độ thu hồi từ 
90,14% đến 98,75%; sai số của phép xác định 
SCR ≤1,653% và độ thu hồi từ 90,44% đến 
99,12%; vitamin B12 có độ thu hồi từ 90,45% 
đến 99,15%. Các kết quả xác định cho thấy 
hàm lượng SCR và ASP trong một số mẫu đồ 
uống đáp ứng tốt tiêu chuẩn Việt Nam [6]. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
[1]. Ana Beatriz Bergamo, José Alberto 
Fracassi da Silva, Dosil Pereira de Jesus 
(2011), “Simultaneous determination of 
aspartam, cyclamate, SCR and acesulfame – K 
in soft drinks and tabletop sweetener 
formulations by capillary electrophoresis with 
capacitively coupled contractless conductivity 
212
detection”, Food Chemistry, 124, pages 1714-
1717. 
[2]. Agata Zygler, Andrzej Wasik, Agata Kot-
Wasik, Jacek Namieśnik (2011), 
“Determination of nine high-intensity 
sweeteners in various foods by high-
performance liquid chromatography with mass 
spectrometric detection”, Anal Bioanal Chem, 
400:2159–2172. 
[3]. Chui-Shiang Chang , Tai Sheng Yeh 
(2014), “Detection of 10 sweeteners in various 
foods by liquid chromatography/tandem mass 
spectrometry”, Journal of food and drug 
analysis , 22 (3) , 318 -328 
[4]. Maja SERDAR, Zorka KNEŽEVIĆ 
(2011), “Determination of artificial sweeteners 
in beverages and special nutritional products 
using high performance liquid 
chromatography”, Arh Hig Rada Toksikol, 62, 
pages 169-173. 
[5]. Shah, Romina and de Jager, Lowri S. 
(2017), "Recent Analytical Methods for the 
Analysis of Sweeteners in Food: A Regulatory 
Perspective", Food and Drug Administration, 
Papers. 5. 
[6]. TCVN 10993 (2015), Thực phẩm-xác định 
đồng thời chín chất tạo ngọt bằng sắc ký lỏng 
hiệu năng cao sử dụng detector tán xạ bay hơi. 
213