Thiết lập quy trình định lượng dna ebv trong máu ngoại vi với độ nhạy cao góp phần sàng lọc phát hiện sớm

ĐẦU VÀ CỔ 
TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM 
74 
THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG DNA EBV TRONG MÁU 
NGOẠI VI VỚI ĐỘ NHẠY CAO GÓP PHẦN SÀNG LỌC 
PHÁT HIỆN SỚM 
HỒ HỮU THỌ1, TRIỆU THỊ NGUYỆT1, ĐỖ TRÂM ANH2, NGUYỄN ĐÌNH ỨNG, ĐINH THỊ THU HẰNG3, 
BÙI TIẾN SỸ4, HOÀNG ĐÀO CHINH5, LÊ MINH KỲ6, VŨ TRƯỜNG PHONG, NGÔ THANH TÙNG7, 
NGUYỄN KIM LƯU8, NGUYỄN VĔN BA, HỒ ANH SƠN3, HOÀNG VĔN LƯƠNG3, NGHIÊM ĐỨC THUẬN2 
TÓM TẮT 
Nhóm nghiên cứu đã thiết lập thành công quy trình định lượng DNA EBV trong máu ngoại vi của những 
bệnh nhân ung thư vòm mũi họng với độ nhạy 96,9%. Đối chiếu với kết quả xét nghiệm trên nhóm chứng là 
những người khỏe mạnh cho thấy độ đặc hiệu là 98%. Quy trình kỹ thuật định lượng cf-DNA EBV đã được 
kiểm định với bộ mẫu chuẩn quốc tế được cung cấp bởi Đại học Hồng Kông. Quy trình được thiết lập trong 
nghiên cứu góp phần sàng lọc phát hiện sớm bệnh ung thư vòm mũi họng. 
SUMMARY 
Development of ultrasensitive q-pcr assay based on circulating EBV DNA for early detection of 
nasopharyngeal carcinoma 
In our study, we have establihed successfully an ultrasensitive qPCR assay for detection cf-EBV DNA. 
Evaluation on clinical samples has proven a remarkably high sensitivity of 96.9% and high specificity of 98%. 
Moreover, we have also validated the performance of the optimal qPCR assay using the international standard 
panel that was provided by Chinese University of Hong Kong. 
1
 Labo Nghiên cứu Gen, Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự - Học viện Quân Y 
2
 Khoa Tai-Mũi-Họng - Bệnh viện Quân Y 103 - Học viện Quân Y 
3
 Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự - Học viện Quân Y 
4
 Khoa Sinh học Phân tử - Bệnh viện Trung Ương Quân Đội 108 
5
 Khoa Xạ phẫu và Xạ trị - Bệnh viện Trung Ương Quân Đội 108 
6
 Trung tâm Ung Bướu và phẫu thuật Đầu cổ - Viện Tai-Mũi-Họng Trung Ương 
7
 Khoa Ung thư Đầu cổ và xạ trị - Bệnh viện K 
8
 Trung tâm Ung Bướu và Y học Hạt nhân - Bệnh viện Quân Y 103 - Học viện Quân Y 
ĐẶT VẤN ĐỀ 
Ung thư vòm mũi họng (UTVMH) là loại ung thư 
rất phổ biến ở một số nước Châu Á, trong đó có Việt 
Nam[1,2]. Bệnh nhân UTVMH thường được chẩn 
đoán ở giai đoạn muộn, đồng thời các triệu chứng 
của bệnh thường không đặc hiệu và khó phân biệt 
với các bệnh lý khác ở vùng lân cận. Bên cạnh đó, 
UTVMH thường có di cĕn hạch sớm[3]. Hậu quả là 
nhiều bệnh nhân UTVMH được chẩn đoán ở giai 
đoạn tiến triển kèm theo di cĕn, điều trị khó khĕn mà 
hiệu quả không cao. 
UTVMH liên quan mật thiết với nhiễm virus 
Epstein Barr (EBV), hệ gen của virus này đã được 
xác định trong hầu hết các tế bào của khối UTVMH. 
Triển vọng to lớn của DNA-EBV lưu hành trong máu 
ngoại vi đối với sàng lọc phát hiện sớm, tiên lượng 
và đánh giá mức độ đáp ứng điều trị UTVMH đã 
được khẳng định qua hàng loạt các nghiên cứu trên 
thế giới trong hơn 15 nĕm qua. Tuy nhiên, hiện vẫn 
chưa có xét nghiệm DNA-EBV chuẩn hóa nào được 
sử dụng trên lâm sàng. Tại Việt Nam, quy trình định 
lượng DNA-EBV hiện nay có độ nhạy còn thấp với 
ngưỡng phát hiện là 300 copy/ml huyết tương, nên 
chỉ phát hiện được DNA-EBV trong máu ngoại vi ở 
64%-68% số bệnh nhân UTVMH[4-6]. Thực tế này đặt 
ra yêu cầu cần thiết lập quy trình phát hiện định 
lượng DNA-EBV trong máu ngoại vi với độ nhạy cao 
ĐẦU VÀ CỔ 
TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM 
75 
ở nước ta, góp phần sàng lọc phát hiện các trường 
hợp mắc ung thư vòm mũi họng ở giai đoạn sớm. 
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
Vật liệu nghiên cứu 
Mẫu bệnh phẩm lâm sàng: Mẫu máu ngoại vi 
được chống đông bằng EDTA của 32 bệnh nhân 
được chẩn đoán xác định UTVMH dựa vào kết quả 
giải phẫu bệnh của sinh thiết vòm mũi họng (nhóm 
bệnh). Mẫu máu ngoại vi được chống đông bằng 
EDTA của 105 người khỏe mạnh (nhóm chứng). 
Các hóa chất dùng trong tách chiết DNA từ 
huyết tương bao gồm bộ Kit tách chiết Anapure 
DNA/RNA Viral Mini Kit, Isopropanol, Ethanol 100%. 
Hóa chất dùng trong phản ứng Realtime PCR như: 
Quantitect Probe master mix, Quantitect SYBR 
master mix, Primer, Probe, DMSO. 
Panel mẫu chuẩn định lượng DNA của EBV với 
giải nồng độ xác định và mẫu huyết tương chuẩn 
dương tính với DNA-EBV của Đại học Hồng Kông, 
được GS. Allen Chan chuyển cho nhóm nghiên cứu. 
Máy Roto-Gene Q, Tủ hút thao tác di truyền, 
máy li tâm, khối ổn nhiệt có lắc, máy vortex, 
NanoDrop. 
Phương pháp nghiên cứu 
Thu thập và bảo quản mẫu 
Mẫu máu tĩnh mạch ngoại vi với thể tích 5ml/lần 
được lấy vào ống chứa chất chống đông K2 EDTA. 
Trong vòng 6h sau khi lấy, mẫu máu được vận 
chuyển đến labo, tách huyết tương. 
Tách chiết DNA từ huyết tương 
DNA huyết tương được tách chiết bằng bộ kit 
Anapure DNA/RNA Viral Mini Kit với quy trình được 
cải tiến góp phần làm tĕng độ nhạy phát hiện DNA-
EBV trong máu ngoại vi. 
Thiết kế trình tự primer/probe cho phản ứng 
realtime PCR 
Trình tự mồi và probe được thiết kế và đánh giá 
bằng phần mềm Oligo Primer Analysis Software. 
Thiết kế 3 bộ primer/probe cho phản ứng Realtime 
PCR định lượng DNA-EBV nhắm vào các vùng DNA 
khác nhau trên bộ gen của EBV: EBNA1, LMP1 và 
BamH1-W. Các bộ primer/probe được đánh giá sơ 
bộ sử dụng chứng dương DNA được tách chiết từ 
mẫu huyết tương chuẩn của Đại học Hồng Kông. Bộ 
primer/probe có tín hiệu khuếch đại sớm và độ đặc 
hiệu cao nhất được lựa chọn để tiếp tục tối ưu thành 
phần phản ứng và chu trình nhiệt. 
Realtime PCR định lượng 
Phản ứng PCR được tiến hành trên hệ thống 
máy Rotor-Gene Q với thể tích phản ứng là 20µl và 
8,6µl dịch chiết DNA được sử dụng làm khuôn. Dữ 
liệu realtime PCR được thu thập bởi hệ thống Rotor-
Gene Q và lưu trong máy tính sau đó sẽ được phân 
tích bằng phần mềm Rotor-Gene Q. Mỗi mẫu được 
chạy 02 lần lặp lại, mỗi lần chạy luôn kèm theo các 
chứng âm không chứa khuôn DNA. Đường chuẩn 
được thiết lập sử dụng mẫu chuẩn DNA quốc tế của 
Đại học Hồng Kông với dãy nồng độ xác định. Giá trị 
trung bình kết quả định lượng của 02 lần lặp lại 
được sử dụng để tính toán nồng độ. 
Phương pháp xử lý số liệu 
Nồng độ của DNA-EBV huyết tương được tính 
theo đơn vị số copy/ml huyết tương. 
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 
Kết quả tối ưu quy trình realtime PCR phát hiện 
DNA-EBV. 
Tiến hành thiết kế các bộ primer/probe như mô 
tả trong phần phương pháp nghiên cứu, bộ 
primer/probe (III) được tiếp tục sử dụng để tối ưu 
thành phần phản ứng và chu trình nhiệt. 
Tối ưu nồng độ mồi 
Hình 1. Tối ưu nồng độ mồi cho phản ứng qPCR 
Các phản ứng realtime PCR (0.1Q), (0.2Q), (0.3Q), 
(0.4Q), (0.5Q) có cùng lượng Khuôn DNA và nồng 
độ primer lần lượt là 0,1µM, 0,2µM, 0,3µM, 0,4µM và 
0,5µM. Phản ứng (am Q) là chứng âm không có 
Khuôn DNA và nồng độ primer 0,2µM. 
Tối ưu nồng độ Probe 
ĐẦU VÀ CỔ 
TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM 
76 
Hình 2. Tối ưu nồng độ probe cho phản ứng 
Realtime PCR 
Các phản ứng realtime PCR (35 0.2-1+), (35 0.1-1), 
(35 0.05-1) có cùng lượng Khuôn DNA và nồng độ 
probe lần lượt là 0,2µM, 0,1µM, 0,05µM. Phản ứng 
(35 0.2-1-) là chứng âm không có Khuôn DNA và 
nồng độ probe là 0,2µM. 
Tối ưu nồng độ DMSO 
Hình 3. Tối ưu nồng độ DMSO cho phản ứng 
Realtime PCR 
Các phản ứng realtime PCR (10%-Q), (7.5%-Q), 
(5%-Q), (2.5%-Q) có cùng lượng Khuôn DNA và 
nồng độ DMSO lần lượt là 10%, 7,5%, 5% và 2,5%. 
Phản ứng (SS-Q) là chứng dương không bổ sung 
DMSO. 
Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime PCR 
TT Các bước Nhiệt độ Thời gian Đơn vị 
1 Biến tính ban đầu 95 15 Phút 
2 Khuếch đại Biến tính 94 15 Giây 
 Số chu kỳ: 
45 
Gắn mồi 63 30 Giây 
 Kéo dài 72 30 Giây 
3 Lưu mẫu 25 ∞ 
Nồng độ các thành phần phản ứng Realtime PCR đã tối ưu: 
STT Thành phần Nồng độ ban đầu Nồng độ phản ứng Đơn vị Thể tích phản ứng (µl) 
1 Quantitect Probe master mix 5 1 X 10 
2 Primer III/F 10 0,2 µM 0,4 
3 Primer III/R 10 0,2 µM 0,4 
4 Probe III 10 0,05 µM 0,1 
5 DMSO 100 2,5 % 0,5 
6 Khuôn DNA 8,6 
 Tổng 20 
Kết quả đánh giá quy trình trên bộ panel mẫu 
chuẩn quốc tế. 
ĐẦU VÀ CỔ 
TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM 
77 
Hình 4. Độ nhạy của quy trình trên bộ panel mẫu 
chuẩn quốc tế 
Toàn bộ số mẫu (9/9) trong bộ panel mẫu chuẩn 
quốc tế với đều cho tín hiệu khuếch đại, mẫu chuẩn 
có nồng độ thấp nhất là 25copy/ml. Chứng âm 
không có khuôn DNA không cho tín hiệu khuếch đại. 
Kết quả thí nghiệm trên cho thấy, quy trình 
realtime PCR tối ưu có độ đặc hiệu cao (chứng âm 
không cho tín hiệu khuếch đại) và có khả nĕng phát 
hiện được mẫu DNA của EBV có nồng độ thấp nhất 
trong bộ panel mẫu chuẩn quốc tế. Kết quả thí 
nghiệm với 10 lần lặp lại cho thấy ngưỡng phát hiện 
của quy trình realtime PCR tối ưu là 25 copy/ml 
huyết tương, tốt hơn rất nhiều so với các nghiên cứu 
khác trong nước đã công bố cho đến nay với 
ngưỡng phát hiện là 300 copy/ml[4-6]. 
Đồng thời, khả nĕng định lượng của quy trình 
realtime PCR tối ưu cũng được đánh giá trên panel 
bộ mẫu chuẩn quốc tế và thu được đường chuẩn với 
hệ số tương quan tuyến tính là R2=0.99613 (Hình 5). 
Như vậy, quy trình realtime PCR tối ưu có tương 
quan tuyến tính rất tốt và có khả nĕng định lượng 
DNA-EBV với độ tin cậy cao. 
Hình 5. Đường chuẩn của quy trình tối ưu trên bộ 
panel mẫu chuẩn quốc tế 
Tương quan tuyến tính giữa giá trị Ct với log của 
nồng độ DNA-EBV có trong các mẫu khác nhau của 
bộ panel mẫu chuẩn quốc tế từ 25 - 150.000copy/ml. 
Đánh giá hiệu quả của quy trình tối ưu trên các mẫu lâm sàng, góp phần sàng lọc phát hiện sớm 
UTVMH 
Hình 5. Độ nhạy, độ đặc hiệu của xét nghiệm định lượng DNA-EBV trong máu ngoại vi 
của bệnh nhân ung thư vòm mũi họng 
Kết quả xác định được DNA-EBV trong máu 
ngoại vi của 96,9% số bệnh nhân UTVMH (31/32), 
do đó độ nhạy của xét nghiệm là 96,9%. Nồng độ 
DNA-EBV trong các mẫu dương tính ở nhóm bệnh 
nhân UTVMH dao động trong khoảng từ 53copy/ml-
3,8x105copy/ml. 
ĐẦU VÀ CỔ 
TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM 
78 
Trên nhóm chứng khỏe mạnh, kết quả DNA-
EBV dương tính ở 2/105 trường hợp, tương ứng với 
độ đặc hiệu là 98% (103/105). Với 2 trường hợp 
nhóm chứng khoẻ mạnh dương tính với DNA-EBV, 
nồng độ DNA-EBV xác định đều dưới 40copies/ml 
và xét nghiệm lại sau 2 tuần đều cho kết quả âm 
tính, giúp phân biệt với những trường hợp dương 
tính thật. 
Như vậy, quy trình định lượng nồng độ DNA-
EBV trong máu ngoại vi đã được thiết lập và đánh 
giá trên panel mẫu chuẩn quốc tế của Đại học Hồng 
Kông với ngưỡng phát hiện là 25copy/ml. Đồng thời, 
đánh giá trên mẫu bệnh phẩm lâm sàng thu được độ 
nhạy 97% và độ đặc hiệu 98%. Kết quả đạt được 
tương đương với các công bố trên thế giới[7,8,9]. 
KẾT LUẬN 
Quy trình realtime PCR định lượng DNA EBV 
với độ nhạy cao (25copy/ml) đã được thiết lập thành 
công trong nghiên cứu này và quy trình đã được 
đánh giá chất lượng trên bộ mẫu chuẩn quốc tế 
đảm bảo độ tin cậy cao. 
Hiệu quả sàng lọc chẩn đoán sớm UTVMH trên 
nhóm đối tượng nghiên cứu của quy trình tối ưu định 
lượng DNA EBV tự do lưu hành trong máu ngoại vi 
đạt được độ nhạy là 96,9% và và độ đặc hiệu 98%. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Yu, W.M. and S.S. Hussain, Incidence of 
nasopharyngeal carcinoma in Chinese 
immigrants, compared with Chinese in China 
and South East Asia: review. J Laryngol Otol, 
2009. 123 (10): p. 1067-74. 
2. Vokes, E.E., D.N. Liebowitz, and R.R. 
Weichselbaum, Nasopharyngeal carcinoma. 
Lancet, 1997. 350(9084): p. 1087-91. 
3. Stacey EM, F.R., "The nose, paranasal sinuses, 
and nasopharynx”, in: Sternberg SS, editor, 
Diagnostic Surgical Pathology, vol1, 3nd edition. 
Lippincott William & Wilkins, Philadelphia, 1999. 
1: p. 885-917. 
4. Phạm Huy Tần, T.H.T., Trần Thị Thuý Hằng, 
Nguyễn Đình Phúc, Trần Vân Khánh, Nồng độ 
EBV-DNA huyết tương của bệnh nhân ung thư 
vòm mũi họng và mối tương quan với chẩn đoán 
giai đoạn TNM (Tumor Nodes Metastasis). Tạp 
chí nghiên cứu Y học, 2015. 95(3): p. 24-31. 
5. Tú, Đ.V., Đánh giá nồng độ EBV-DNA trong 
huyết tương bệnh nhân ung thư vòm mũi họng 
giai đoạn II-III trước và sau điều trị. Luận vĕn tốt 
nghiệp bác sỹ nội trú, Trường Đại học Y Hà Nội, 
2012. 
6. Nguyễn Tuyết Mai, Đ.V.T., Mối tương quan giữa 
nồng độ EBV-DNA huyết tương với kết quả điều 
trị trong ung thư vòm họng giai đoạn II, III tại 
bệnh viện K. Y học Việt Nam, 2012. 1: p. 43-46. 
7. Lo, Y.M., et al., Quantitative analysis of cell-free 
Epstein-Barr virus DNA in plasma of patients 
with nasopharyngeal carcinoma. Cancer Res, 
1999. 59(6): p. 1188-91. 
8. Shao, J.Y., et al., Comparison of plasma 
Epstein-Barr virus (EBV) DNA levels and serum 
EBV immunoglobulin A/virus capsid antigen 
antibody titers in patients with nasopharyngeal 
carcinoma. Cancer, 2004. 100(6): p. 1162-70. 
9. Kondo, S., et al., Diagnostic value of serum 
EBV-DNA quantification and antibody to viral 
capsid antigen in nasopharyngeal carcinoma 
patients. Cancer Sci, 2004. 95(6): p. 508-13.