Luận văn Xác định hàm lượng crinamidin trong thuốc và thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng sắc ký khí khối phổ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI 
LÊ THỊ LIÊN 
XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CRINAMIDIN 
TRONG THUỐC VÀ THỰC PHẨM BẢO VỆ 
SỨC KHỎE BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ 
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC 
HÀ NỘI 2018
 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI 
LÊ THỊ LIÊN 
XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CRINAMIDIN 
TRONG THUỐC VÀ THỰC PHẨM BẢO VỆ 
SỨC KHỎE BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ 
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC 
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT 
MÃ SỐ: 8720210 
Người hướng dẫn khoa học: TS. Trần Nguyên Hà 
 PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo 
HÀ NỘI 2018 
 LỜI CẢM ƠN 
 Trong thời gian thực hiện luận văn này, tôi đã rất may mắn khi nhận được sự 
giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các chuyên gia, các nghiên cứu viên, các anh chị 
kỹ thuật viên cùng tình cảm và sự khích lệ mà gia đình và bạn bè đã dành cho tôi. 
Tôi xin được bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trần 
Nguyên Hà và PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo đã giao đề tài, luôn tâm huyết và tận 
tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn. 
 Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành tới TS. Trần Cao Sơn đã 
cho tôi những lời khuyên quý báu, dành nhiều thời gian và tạo điều kiện tối đa giúp 
đỡ tôi hoàn thành luận văn này. 
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Cao Công Khánh cùng các anh chị, các 
bạn khoa Nghiên cứu thực phẩm, khoa Độc học & dị nguyên, khoa Chất lượng, phụ 
gia và chất hỗ trợ chế biến thực phẩm – Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực 
phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện 
luận văn. 
 Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám Hiệu, phòng Sau đại học, bộ 
môn Hóa phân tích – trường Đại học Dược Hà Nội, cùng các thầy cô đã giảng dạy 
và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường. 
 Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè – những người đồng 
hành không thể thiếu trong học tập và cuộc sống đã luôn động viên và khích lệ tôi 
những ngày qua. 
 Tôi xin chân thành cảm ơn! 
 Hà Nội, ngày 28 tháng 03 năm 2018 
Học viên 
Lê Thị Liên 
 MỤC LỤC 
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU 
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ 
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 
PHẦN 1. TỔNG QUAN ............................................................................................ 3 
1.1. Tổng quan về cây trinh nữ hoàng cung ......................................................... 3 
1.1.1. Đặc điểm thực vật ......................................................................................... 3 
1.1.2. Nguồn gốc và phân bố, bộ phận sử dụng ..................................................... 4 
1.1.3. Thành phần hóa học của cây Crinum latifolium L. ...................................... 4 
1.1.4. Tác dụng sinh học ......................................................................................... 5 
1.2. Tổng quan về crinamidin ................................................................................ 5 
1.3. Một số nghiên cứu xác định crinamidin ........................................................ 7 
PHẦN 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 15 
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .................................................................................... 15 
2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu ................................................................................ 15 
2.2.1. Chất chuẩn .................................................................................................. 15 
2.2.2. Hóa chất, dung môi ..................................................................................... 16 
2.2.3. Thiết bị, dụng cụ ......................................................................................... 16 
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 17 
2.3.1. Xây dựng phương pháp định lượng crinamidin trong thuốc và TPBVSK .. 17 
2.3.2. Thẩm định phương pháp định lượng crinamidin bằng kỹ thuật GC-MS/MS .... 19 
2.4. Ứng dụng phƣơng pháp để xác định hàm lƣợng crinamidin trong thuốc 
và TPBVSK ........................................................................................................... 21 
2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu ............................................................................. 21 
PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................................... 22 
3.1. Xây dựng phƣơng pháp phân tích ............................................................... 22 
3.1.1. Kết quả khảo sát các điều kiện tối ưu cho phương pháp định lượng 
crinamidin bằng GC-MS/MS ................................................................................ 22 
 3.1.2. Kết quả khảo sát quá trình xử lý mẫu cho phương pháp định lượng 
crinamidin bằng GC-MS/MS ................................................................................ 29 
3.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích ............................................................. 39 
3.2.1. Tính thích hợp của hệ thống ....................................................................... 39 
3.2.2. Tính đặc hiệu, chọn lọc ............................................................................... 40 
3.2.3. Khoảng tuyến tính ....................................................................................... 44 
3.2.4. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng .................................................... 45 
3.2.5. Độ lặp lại .................................................................................................... 46 
3.2.6. Độ thu hồi ................................................................................................... 48 
3.3. So sánh phƣơng pháp xây dựng với phƣơng pháp tiêu chuẩn Dƣợc điển 
Việt Nam IV ............................................................................................. ... id nhân purin tìm thấy trong hạt cà phê và các bộ phận của cây 
chè (Camellia sinensis L.) [9], cacao (Theobroma cacao L.), cây cô la (Cola sp.) 
[10], công thức phân tử: C8H10N4O2 (M = 194,19 g/mol). Cafein ở dạng tinh thể, 
không màu, không mùi, vị đắng. Thăng hoa ở 178oC, nhiệt độ nóng chảy 238oC. 
Tan nhiều trong nước và CHCl3 [36]. Cafein có tác dụng trợ tim và lợi tiểu nhẹ [9], 
kích thích thần kinh trung ương, tăng cường sự tỉnh táo, có thể gây nhịp tim nhanh, 
khả năng gây nghiện [28]. Khoảng tuyến tính giữa nồng độ và tỷ lệ diện tích pic 
crinamidin/diện tích cafein với R2 = 0,9970 > 0,995 trong khoảng nồng độ từ 5 đến 
50 µg/mL (tương ứng với 50 – 500 µg/g). Phương pháp xây dựng có độ lặp lại tốt, 
độ thu hồi trên ba nền mẫu khác nhau (viên nang cứng, trà túi lọc, cao lỏng) đều đạt 
yêu cầu của AOAC. Do đó phương pháp này phù hợp để xác định crinamidin trong 
các chế phẩm TNHC. Tuy nhiên, chỉ ba đối tượng nền mẫu của các chế phẩm phổ 
biến được lựa chọn để thẩm định mà chưa thẩm định được trên tất cả các đối tượng 
nền mẫu. 
Qua thực nghiệm so sánh hiệu quả của phương pháp tiêu chuẩn của DĐVN 
IV sử dụng phương pháp HPLC và phương pháp xây dựng sử dụng kỹ thuật GC-
MS/MS, đồng thời tham khảo tài liệu [11], nhận thấy phương pháp xây dựng cho 
hiệu suất chiết cao hơn, LOD và LOQ nhỏ hơn nhiều lần, có thể định lượng chế 
phẩm hàm lượng nhỏ hơn nhiều lần, tiết kiệm thời gian và dung môi, hóa chất. Vì 
vậy phương pháp xây dựng phù hợp trong việc góp phần tiêu chuẩn hóa các chế 
phẩm có chứa thành phần TNHC. 
4.3. Ứng dụng phƣơng pháp để xác định hàm lƣợng crinamidin trên mẫu thực 
63 
Qua xác định hàm lượng crinamidin từ 48 mẫu viên nang cứng, viên nén, trà 
túi lọc, cao khô, cao phun sấy và cao lỏng thu thập trên thị trường và mẫu tại Viện 
kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia. Kết quả hàm lượng crinamidin 
không đồng đều, cụ thể như sau: 
 Hàm lượng crinamidin trong 30 chế phẩm dạng viên (viên nang cứng và viên 
nén) dao động trong khoảng từ 0 đến 223,7 µg/viên. Trong đó có 10 mẫu 
không phát hiện crinamidin, chủ yếu ở dạng viên nang cứng. Viên nang cứng 
và viên nén chủ yếu được bào chế từ nguyên liệu lá TNHC với dung môi 
chiết là nước. Qua khảo sát quy trình chiết xuất nhận thấy việc sử dụng dung 
môi nước cho hiệu suất chiết không cao, là một trong những nguyên nhân 
gây ra sự dao động hàm lượng crinamidin trong các chế phẩm. Bên cạnh đó, 
10 mẫu chứa hàm lượng crinamidin nhỏ hơn giá trị LOQ có thể do nguồn 
nguyên liệu không đạt tiêu chuẩn, sử dụng các bộ phận khác của cây TNHC 
hoặc có sự nhầm lẫn, thay thế bằng các loại dược liệu khác không chứa 
crinamidin. 
 Hàm lượng crinamidin trong 13 mẫu cao thay đổi rộng, cụ thể: dao động từ 
0,95 mg/100g đến 14,2 mg/100g đối với dạng cao khô, từ 0,065 mg/100g đến 
9,61 mg/100g đối với dạng cao phun sấy và cao lỏng. Dạng cao phun sấy và 
cao lỏng chủ yếu được bào chế từ nguyên liệu lá TNHC với dung môi chiết 
là nước. Dạng cao lỏng thay đổi trong khoảng rộng do được chiết xuất ban 
đầu từ hỗn hợp nguyên liệu. Điều này cho thấy chất lượng nguyên liệu đưa 
vào sản xuất chưa được chuẩn hóa và/hoặc quy trình chiết xuất chưa được tối 
ưu hóa. 
 Hàm lượng crinamidin trong 5 mẫu trà túi lọc có hàm lượng đồng đều hơn do 
quy trình sản xuất đơn giản, chỉ bao gồm xay thô và đóng gói. 
Hàm lượng crinamidin trong các chế phẩm TNHC thay đổi trong khoảng 
rộng. Nghiên cứu đã góp phần trong từng bước tiêu chuẩn hóa các chế phẩm chứa 
thành phần TNHC để đạt được sự đồng đều hàm lượng crinamidin trong các chế 
phẩm, bảo đảm quyền lợi người sử dụng, đồng thời giải quyết được vấn nạn thuốc 
và TPBVSK thật hay giả hiện nay. 
64 
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 
Kết luận 
1. Đã khảo sát và lựa chọn điều kiện chiết xuất crinamidin từ các chế phẩm viên 
nang cứng, trà túi lọc và cao lỏng bằng phương pháp chiết alkaloid dưới dạng base 
sử dụng dung môi hữu cơ. Từ đó xây dựng quy trình chiết chung cho cả 3 nền mẫu 
đã khảo sát. Cụ thể: 
- Lựa chọn số lần chiết cho mỗi đối tượng là 2 lần. 
- Lựa chọn được thời gian chiết tối ưu cho mỗi lần chiết xuất là 1 giờ. 
- Lựa chọn tỷ lệ hỗn hợp dung môi CHCl3 : MeOH = 3 : 1. 
2. Lựa chọn được chuẩn nội là cafein cho định lượng crinamidin. 
3. Đã lựa chọn được điều kiện phân tích crinamidin bằng GC-MS/MS 
- Tách bằng sắc ký khí sử dụng cột DB5-MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm). 
Chương trình nhiệt độ: nhiệt độ đầu 100oC, giữ 1 phút, tăng nhiệt với tốc độ 
20
oC/phút đến 240oC, giữ 1 phút. Tiếp tục tăng 5oC/phút lên đến 290oC, giữ 
6 phút. 
- Phân tích MS/MS với EI 70 eV, chế độ MRM. 
4. Đã thẩm định phương pháp xác định hàm lượng crinamidin trong chế phẩm với 
các kết quả như sau: 
- Phương pháp có tính chọn lọc đáp ứng yêu cầu; sau khi bắn phá crinamidin 
qua MS/MS lựa chọn ba ion con, một ion được sử dụng để định lượng và hai 
ion dùng để khẳng định sự có mặt của crinamidin trong mẫu. Bên cạnh đó 
lựa chọn hai ion của cafein, một ion con được sử dụng để định lượng và một 
ion con được dùng để xác nhận. 
- Khoảng tuyến tính với R2 = 0,9970 trong khoảng nồng độ từ 5 đến 50 µg/mL 
(tương ứng với 50 – 500 µg/g). 
- Giới hạn định lượng của crinamidin là 1 µg/mL (tương ứng 10 µg/g). 
- Độ lặp lại của phương pháp có độ lệch chuẩn tương đối từ 4,5% đến 4,9 % 
trên các nền nang cứng, trà túi lọc và cao lỏng. 
65 
- Độ thu hồi trên nền nang cứng, trà túi lọc và cao lỏng thuộc khoảng 90,0% 
đến 107,0% đáp ứng yêu cầu AOAC. 
5. So sánh phương pháp đã xây dựng với phương pháp tiêu chuẩn của Dược điển 
Việt Nam IV, phương pháp đã xây dựng có các ưu điểm sau: 
 - Quy trình chiết đã xây dựng cho hiệu suất chiết cao hơn so với quy trình 
chiết của tiêu chuẩn DĐVN IV. Phương pháp đã xây dựng sử dụng chuẩn nội là 
cafein, độ lặp tốt, giảm thiểu được các sai số trong phân tích. 
 - Phương pháp đã xây dựng có giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng thấp 
hơn so với phương pháp tiêu chuẩn DĐVN IV, có thể định lượng những mẫu có 
hàm lượng nhỏ hơn. 
 - Thời gian phân tích bằng GC-MS/MS không quá dài, chỉ khoảng một nửa 
thời gian phân tích so với HPLC, đồng thời tiết kiệm thời gian hoạt hóa, rửa cột mà 
HPLC cần cho mỗi lần phân tích. Bên cạnh đó, thời gian lưu của pic chính và chuẩn 
nội khi phân tích bằng GC-MS/MS ổn định, RSD thời gian lưu tR (các lần phân tích, 
các ngày phân tích khác nhau) < 2%, ít chịu ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài. 
6. Đánh giá xác định hàm lượng crinamidin trên 48 mẫu thuốc và TPBVSK. Trong 
đó có 10 mẫu không phát hiện crinamidin. Hàm lượng crinamidin trong 38 mẫu còn 
lại thay đổi trong khoảng rộng giữa các chế phẩm có cùng dạng bào chế. 
Kiến nghị 
1. Áp dụng phương pháp xây dựng tại các phòng thí nghiệm có thiết bị GC-MS/MS 
để xác định hàm lượng crinamidin đại trà. 
2. Tiếp tục nghiên cứu liên phòng thí nghiệm nhằm bổ sung phương pháp đã xây 
dựng vào hệ thống tiêu chuẩn kiểm nghiệm quốc gia phục vụ cho việc quản lý thuốc 
và TPBVSK. 
 TÀI LIỆU THAM KHẢO 
Tiếng Việt 
1. Trần Tử An, Thái Nguyễn Hùng Thu (2012), Hóa phân tích tập II, NXB Y học. 
2. Nguyễn Tuấn Anh, Phạm Thị Giảng, Trịnh Văn Quỳ (2006), "Nghiên cứu 
định tính, định lượng Crinamidin trong dược liệu và viên nang Trinh nữ 
hoàng cung bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao", Tạp chí KIỂM 
NGHIỆM THUỐC, 4(4), pp. 10 - 14. 
3. Bộ Y Tế (2015), Dược điển Việt Nam IV Bản bổ sung, NXB Y học, Hà Nội, 
pp. 1182 - 1184. 
4. Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y Học, pp. PL 125 - 127. 
5. Bộ Y Tế, Thông tư ban hành Danh mục thuốc thiết yếu lần VII Bản dự thảo. 
p. 51 - 52. 
6. Chính phủ Nghị định 65/2017/NĐ-CP, Chính sách đặc thù về giống, vốn và 
công nghệ trong phát triển nuôi trồng, khai thác dược liệu. 2017. 
7. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, Hà Nội, pp. 500. 
8. Võ Thị Bạch Huệ, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Ngô Vân Thu, Delome 
Frederic, Daniel F. Michel Bechi (1999), "Khảo sát alcaloid chiết từ lá cây 
Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L. Amaryllidaceae) bằng kỹ thuật 
GC-MS", Tạp chí Dược học, 4, pp. 9-11. 
9. Phạm Thanh Kỳ (2007), Dược liệu học Tập II, NXB Y học. 
10. Đỗ Tất Lợi (2015), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà 
Nội, pp. 510 - 512; 915-918; 924-926. 
11. Phạm Luận (2014), Phương pháp phân tích sắc ký và chiết tách, Nhà xuất 
bản Bách khoa Hà Nội. 
12. Trần Cao Sơn - Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia 
(2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học & vi sinh vật, NXB 
khoa học và kỹ thuật. 
13. Nguyễn Viết Thân (2004), Những cây thuốc, vị thuốc thường dùng. 
14. Nguyễn Nhật Thành, Phạm Thị Ninh, Trần Thị Phương Thảo, Hoàng Minh 
Châu, Trần Văn Sung (2011), "Nghiên cứu thành phần hóa học lá cây trinh 
nữ hoàng cung (Crinum latifolium) trồng ở Đồng Nai, Việt Nam", Tạp chí 
Hóa học, (49), pp. 355 -361. 
15. Thủ tướng chính phủ 1976/QĐ-TTg, Quyết định phê duyệt quy hoạch tổng 
thể phát triển dược liệu đến năm 2020 và định hướng đến năm 2030. 2013. 
16. Nguyễn Hữu Lạc Thủy (2014), Nghiên cứu thành phần hóa học, thiết lập 
chất đối chiếu và xây dựng quy trình kiểm nghiệm thành phần alkaloid và 
flavonoid cho cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L. 
Amaryllidaceae), Luận án tiến sĩ Dược học, Đại học Y Dược thành phố Hồ 
Chí Minh. 
17. Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Nguyễn Hồng Thiên Thanh, Võ Thị Bạch Huệ 
(2013), "Phân lập và xây dựng chất chuẩn crinamidin từ lá trinh nữ hoàng 
cung Crinum latifolium L.", Tạp chí Dược học, 441, pp. 38 - 41. 
18. Tuệ Tĩnh 3033 cây thuốc đông y y học cổ truyển Tuệ Tĩnh. 
19. Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Dương Thị Thúy Nga, Nguyễn Thị Tường Vy, 
Phạm Quỳnh Khoa, Hà Diệu Ly, Hà Hồi, Nguyễn Minh Đức (2016), "Điều 
chế và thiết lập chất chuẩn crinamidin", Tạp chí Dược học, 477, pp. 52-57. 
20. Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Phan Thị Phi Phi, Phan Thị Thu Anh (2008), "Tác 
dụng phục hồi thương tổn tế bào Lympho T và dòng tủy của viên nang Crila 
trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)", Tạp chí Dược học, 5, pp. 10 - 14. 
Tiếng Anh 
21. Association of Official Analytical Chemists (2002), AOAC Guidelines for 
Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements 
and Botanicals. 
22. Daniel C. Harris (2006), Quantitative Chemical Analysis, seventh edition 
Craig Bleyer, W.H Freeman and Company, New York, pp. 474-555. 
23. David M. Bliesner (2006), Validating chromatographic methods - A pratical 
guide, Wiley - interscience. 
24. Edmond de Hoffmann, Vincent Stroobant (2007), Mass Spectrometry 
Principles and Applications, Third edition, Wiley, pp. 217-221. 
25. Elena Stashenko and Jairo René Martínez (2014), Gas Chromatography - 
Mass Spectroscopy, Advances in Gas Chromatography, Xinghua Guo (Ed.), 
Intech. 
26. Francesc Viladomat, Giovanna R. Almanza, Carles Codina, Jaume Bastida, 
William E. Campbell, Shaheed Mathee (1996), "Alkaloid from Brunsvigia 
orientalis", Phytochemistry, 43(6), pp. 1379-1384. 
27. Shibnath Ghosal, Kulwant S. Saini, August Wilhelm Frahm (1983), 
"Alkaloids of Crinum latifolium", Phytochemistry, 22, pp. 2305 - 2309. 
28. Jasvinder Chawla, Amer Suleman (2017), "Neurologic Effects of Caffeine", 
Medscape. 
29. John Refaat, Mohamed S. Kamel, Mahmoud A. Ramadan and Ahmed A. Ali 
(2013), "Crinum; an endless source of bioactive principles: A review. Part V. 
Biological profile", International journal of pharmaceutaical sciences and 
research, 4(4), pp. 1239 - 1252. 
30. Jonathan MELVILLE (2014), "GC/MS Analysis of Caffeine", UC Berkeley 
College of Chemistry. 
31. Levin S "Traditional Vietnamese herb Crinum latifolium shows promise for 
prostate and ovarian health", International Journal of Immunopharmacology, 
1(12), pp. 2143-2150. 
32. Marcel Jenny, Angela Wondrak , Elissaveta Zvetkova, Nguyen Thi Ngoc 
Tram, Phan Thi Phi Phi, Harald Schennach, Zoran Culig, Florian Ueberall, 
Dietmar Fuchs (2011), "Crinum latifolium leave extracts suppress immune 
activation cascades in peripheral blood mononuclear cells and proliferation 
of prostate tumor cells", Scientia Pharmaceutica, 79(2), pp. 323 - 336. 
33. Nguyen Hai Nam, Kim Yong, et al. (2004), "New constituents from Crinum 
latifolium with inhibitory effects against tube-like formation of human umbilical 
venous endothelial cells", Natural Product Research 18(6), pp. 485 - 491. 
34. Quincy A. Edwards Sherry-Anne S. Hinkson, Leah D. Garner-O’neale And 
Sergei M. Kulikov (2015), "Quantification of caffeine in selected beverages 
via gas chromatography mass spectroscopy", Sadguru Publications. 
35. Shigeru Kobayashi, Tokumoto Toshihiro, Kihara Masaru, Imakura Yasuhiro, 
Shingu Tetsuro, Taira Zenei (1984), "Alkaloidal constituents of Crinum 
latifolium and Crinum bulbispermum (Amaryllidaceae)", Chemical and 
Pharmaceutical Bulletin, 32, pp. 3015 - 3022. 
36. Tadelech Atomssa and A.V. Gholap (2011), "Characterization of caffeine 
and determination of caffeine in tea leaves using uv-visible spectrometer", 
African Journal of Pure and Applied Chemistry, 5(1), pp. 1-8. 
37. The Commission of The European Communities (2012), "Comission 
Decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC 
concerning the performance of analytical methods and the interpretation of 
results (2002/657/EC)", Official Journal of the European Communities. 
38. Nguyen Thi Ngoc Tram, Maya Mitova, Vassya Bankova, Nedyalka 
Handjieva, Simeon S. Popov (2002), "GC-MS of Crinum latifolium L. 
Alkaloids", Z. Naturforsch C., 57 (3-4), pp. 239 - 242. 
39. Nguyen Thi Ngoc Tram, Zornitza G. Kamenarska, Nedyalka V. Handjieva, 
Vassya S. Bankova, Simeon S. Popov (2003), "Volatiles from Crinum 
latifolium", Journal of Essential Oil Research, 15(3), pp. 195-197. 
40. Zvetkova E, Wirleitner B, Tram N, Schennach H and Fuchs D (2001), 
"Aqueous extracts of Crinum latifolium (L.) and Camellia sinensis show 
immunomodulatory properties in human peripheral blood mononuclear 
cells", Journal of International Immunopharmacology, 1(12), pp. 2143-2150.