Nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật Multiplex PCR trong phát hiện vi khuẩn Salmonella sp. và Staphylococcus aureus gây ngộ độc thực phẩm

Tạp chí Khoa học Công nghệ và Thực phẩm 18 (1) (2019) 23-35 
23 
NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR 
TRONG PHÁT HIỆN VI KHUẨN Salmonella sp. 
VÀ Staphylococcus aureus GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM 
Nguyễn Thành Luân*, Lường Thị Hiếu, Cao Nguyễn Khánh Linh 
Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM 
*Email: luannt@cntp.edu.vn 
Ngày nhận bài: 13/5/2018; Ngày chấp nhận đăng: 06/3/2019 
TÓM TẮT 
Việc phát hiện và định danh vi sinh vật trong thực phẩm nhằm nhanh chóng phát hiện 
các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm và ngăn ngừa một cách có hiệu quả các tác hại từ 
ngộ độc thực phẩm là thực tế và cấp thiết. Tuy nhiên, các phương pháp nuôi cấy hiện nay 
chủ yếu là truyền thống, tốn nhiều thời gian, phức tạp và độ đặc hiệu chưa cao. Kỹ thuật 
multiplex PCR ứng dụng nhanh chóng và đơn giản, có độ nhạy cao và đồng thời khuếch đại 
đồng thời hai hay nhiều chuỗi gen trong phản ứng tương tự nhằm phát hiện một loạt các tác 
nhân gây bệnh chỉ trong một phép phân tích. Kết quả nghiên cứu đã xây dựng thành công 
quy trình phát hiện nhanh vi khuẩn Salmonella sp. và Staphylococcus aureus bằng kỹ thuật 
multiplex PCR có tiềm năng rất lớn trong xác định mẫu thực phẩm nhiễm khuẩn. Phản ứng 
tối ưu cho multiplex PCR được nghiên cứu và lựa chọn ở thể tích 25 µL với 2,5 µL 10X 
PCR buffer, 1,5 µL 25 mM MgCl2, 3 µL 2,5 mM dNTPs; 1 µL mỗi mồi invA; 2 µL mỗi mồi nuc; 
10 µL DNA khuôn và 1,8 µL dH2O. Độ nhạy của phản ứng Multiplex PCR được xác định 
với mật độ 3 × 102 CFU/mL đối với Salmonella sp. và 7 × 101 CFU/mL đối với Staphylococcus 
aureus được thực hiện trong thời gian tăng sinh cần thiết của các mẫu thực phẩm nghi ngờ. Mẫu 
thực phẩm nhiễm Salmonella sp. và Staphylococcus aureus với 1 CFU/ 25 g mẫu được tiến 
hành sau 14 giờ nuôi cấy. Việc đánh giá các đặc hiệu của nghiên cứu này cho các nhóm vi 
khuẩn khác trong nhóm vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm cũng cần được phát triển ở những 
nghiên cứu rộng và đa dạng hơn về các loại thực phẩm dễ nhiễm khuẩn. 
Tử khóa: invA, multiplex PCR, ngộ độc thực phẩm, nuclease, Salmonella sp., Staphylococcus 
aureus. 
1. MỞ ĐẦU 
Đảm bảo chất lượng và an toàn thực phẩm đang là mối quan tâm đặc biệt đối với Việt 
Nam và trên thế giới. Các loại thực phẩm như thịt động vật, gia cầm, trứng và các sản phẩm 
sữa bán ở các chợ và cửa hàng lại không đảm bảo được chất lượng vệ sinh. Theo số liệu 
thống kê của Cục An toàn Vệ sinh Thực phẩm trong quý 1 năm 2018, khi thanh tra gần 
160.000 cơ sở sản xuất và phân phối thực phẩm đã phát hiện hơn 31.000 cơ sở vi phạm với 
tổng số tiền hơn 20 tỷ đồng, đình chỉ hoạt động hơn 72 cơ sở, cấm lưu hành hơn 228 loại 
thực phẩm, tiêu hủy hơn 1.500 loại thực phẩm không đảm bảo chất lượng. Trong năm 2018, 
Việt Nam đã xảy ra 10 vụ ngộ độc thực phẩm làm 972 người mắc, trong đó 726 người phải 
nhập viện và đã có 4 trường hợp tử vong trong đó nhiều nhất là nhóm vi khuẩn cơ hội ký 
sinh từ vi khuẩn Gram âm và Gram dương chiếm hơn 40% các ca ngộ độc thực phẩm [1]. 
Bên cạnh đó, các thói quen sinh hoạt, ăn uống cũng như chế biến thực phẩm hiện nay chủ 
yếu diễn ra tại các quy mô chợ dân sinh hoặc việc đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm còn 
thô sơ làm cho nguy cơ tạp nhiễm khi chế biến bùng phát trong những năm gần đây [1]. 
 g n Thành n ng Th i n Cao g n Kh nh inh 
24 
Trong các nguy cơ tạp nhiễm cao, các nhóm vi khuẩn có thể nhiễm nhiều nhất là 
Campylobacter, Salmonella, Coliforms, Escherichia coli, Vibrio spp., Staphylococcus sp. 
thường được chú ý vì sự xuất hiện thường xuyên của chúng trong các nhiễm khuẩn từ thực 
phẩm. Đặc biệt nhóm vi khuẩn Salmonella sp. và Staphylococcus aureus là 2 vi khuẩn điển 
hình cho Gram âm và Gram dương gây bệnh phổ biến hiện nay và nguy cơ cao trong việc 
kháng kháng sinh trong điều trị các bệnh truyền nhiễm [2]. Nhiều nghiên cứu về tình trạng 
kháng kháng sinh và gây tử vong cao khi nhiễm độc vi khuẩn Salmonella sp. và 
Staphylococcus aureus được các đánh giá nhiễm bệnh ở các bệnh viện cũng như truyền 
nhiễm chéo [2, 3]. Bên cạnh đó, các nhóm tiêu chuẩn Việt Nam và quốc tế đều quy định 
nghiêm ngặt cho việc sản xuất, đóng gói, bảo quản cũng như xuất khẩu hiện nay đều chú 
trọng việc đánh giá tình trạng mẫu có tồn tại sự hiện diện của 2 nhóm vi khuẩn này [3]. Một 
trong những lý do được xác định là khả năng gây ngộ độc và độc tính của những loài vi 
khuẩn này có khả năng ảnh hưởng đến sức khỏe con người và vật nuôi và trực tiếp hấp thu 
qua đường tiêu thụ thực phẩm. Việc phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn này chỉ được quan 
tâm khi có tình trạng gây bệnh diễn ra hoặc được cấp cứu ở trình trạng nguy kịch cho sức 
khỏe vật chủ. Vì vậy, việc cần phát triển một kỹ thuật có thể giúp phát hiện nhanh sự có mặt 
của nhóm vi khuẩn này cũng như cho kết quả thay thế kiểm nghiệm sinh hóa truyền thống sẽ 
giúp ích rất nhiều cho liệu pháp điều trị về sau cũng như biện pháp phòng tránh nếu phát 
hiện chúng trong mẫu thực phẩm [3]. 
Trong sự phát triển của sinh học phân tử, các vùng gen đặc hiệu để phát hiện các loại vi sinh 
vật gây bệnh, đặc biệt các vi khuẩn thuộc chi Salmonella sp. và loài Staphylococcus aureus đã 
được nghiên cứu và ứng dụng trong việc xác định bộ KIT định danh nhanh cho các loài bằng cặp 
mồi đặc hiệu thông qua việc khuếch đại DNA nhanh bằng enzyme polymerase qua phản ứng 
PCR [2]. Các kỹ thuật sinh học phân tử nhờ vậy đã được ứng dụng nhiều trong việc phát hiện 
nhanh các tác nhân gây bệnh dựa trên các dấu hiệu phân tử mang tính đặc hiệu của loài [2]. Kỹ 
thuật PCR hiện nay được ứng dụng nhiều nhất trong các xét nghiệm vi sinh các mẫu bệnh phẩm 
từ các dịch máu, nước tiểu, đờm và các đánh giá miễn dịch khác [2, 3]. Những ứng dụng này 
thường được đánh giá thao tác nhanh chóng, chính xác và đơn giản. Tuy nhiên, kỹ thuật PCR 
truyền thống thường mất nhiều công sức trong thiết kế phản ứng và chỉ khuếch đại được một 
đoạn gen của một loại vi khuẩn nhất định. Điều đó gây hạn chế trong việc xác định nguyên nhân 
gây ngộ độc thực phẩm và trả  ... trong phản ứng multiplex PCR thử nghiệm (Hình 5, Bảng 4). 
Bảng 4. Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi và DNA lên phản ứng PCR 
Nhiệt độ Tm 53 °C 54 °C 55 °C 56 °C 57 °C 58 °C 
Sản phẩm PCR của gen invA + + + + + + 
Sản phẩm PCR của gen nuc + + + + + + 
+: phản ứng dương tính; -: phản ứng âm tính 
Hình 5. Kết quả điện di đánh giá kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi và DNA lên phản ứng PCR 
(Hình A) M: thang DNA, giếng 1–6 nhiệt độ từ 53–58 °C với cặp mồi invAF-R, giếng số 7: chứng âm; 
(Hình B) giếng 1–6 nhiệt độ từ 53–58 °C với cặp mồi nucF-R; giếng số 7: chứng âm. 
500bp 
500bp 
250bp 
250bp 
 ghi n c và ng ng h ip C ong ph hiện vi h ẩn a on a p 
31 
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng multiplex PCR biểu hiện 2 phản ứng 
dương tính đều xuất hiện 2 vạch DNA rõ ràng ở nồng độ agarose 1% (Hình 6). Trong đó, 
vạch thứ nhất có kích thước 439 bp tương ứng với kích thước của sản phẩm PCR khuếch đại 
vùng gen nuclease (nuc) của Staphylococcus aureus bởi cặp mồi nucF-R và vạch thứ 2 có 
kích thước 284 bp tương ứng với kích thước của sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen xâm 
nhiễm (invasive) của vi khuẩn Salmonella sp. bởi cặp mồi invAF-R. Kết quả này cho phép 
khẳng định phản ứng multiplex PCR với nhiệt độ gắn mồi là 53 °C hoàn toàn có thể khuếch 
đại đặc hiệu vùng gen mục tiêu tương ứng. Tuy nhiên, việc so sánh cường độ giữa 2 vạch sản 
phẩm DNA thu được của phản ứng multiplex PCR trong hình ảnh điện di, cường độ hai vạch 
sản phẩm được khuếch đại bởi cặp mồi nucF/R (439 bp) có kích thước lớn hơn so với cường 
độ vạch sản phẩm khuếch đại bởi cặp mồi invAF/R (284 bp) dù nồng độ DNA khuôn của hai vi 
khuẩn sử dụng là tương đương nhau. Điều này cho thấy ở nhiệt độ 53 °C phản ứng multiplex 
PCR với cặp mồi nucF/R có hiệu quả khuếch đại cao hơn so với cặp mồi invAF/R. 
Hình 6. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm multiplex PCR với cặp mồi invAF/R và nucF/R nồng độ 
0,6 µg/µL sử dụng khuôn DNA tổng số của Salmonella sp. 
và 60 ng/µL DNA tổng số của Staphylococcus aureus. 
(Giếng M: thang chuẩn DNA 1kb; giếng 1: mẫu kiểm chứng âm tính; 
giếng số 2 và 3: mẫu kiểm chứng dương tính). 
3.2.4. Thử nghiệm xác định độ nhạy của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng 
thời Salmonella sp. và Staphylococcus aureus 
Ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex PCR được xác định là nồng độ DNA thấp nhất ở 
300 CFU/mL đối với Salmonella sp. và 70 CFU/mL đối với Staphylococcus aureus mà vẫn cho 
phép nhận diện sản phẩm khuếch đại DNA từ phản ứng PCR qua điện di agarose 1% (Bảng 5, 
Hình 7). Khi nồng độ khuôn của Salmonella sp. giảm đến 30 CFU/mL và nồng độ 
Staphylococcus aureus giảm xuống 7 CFU/mL thì sản phẩm PCR không còn xuất hiện trên ảnh 
điện di ở giếng số 8. Giới hạn phát hiện là 30 CFU/mL đối với Salmonella sp. và 7 CFU/mL đối 
với Staphylococcus aureus. Có thể kết luận việc nhận diện tối thiểu của phương pháp này đối với 
Salmonella sp. nên dùng ở 300 CFU/mL trở lên, 70 CFU/mL đối với Staphylococcus aureus. 
Bảng 5. Mật độ tế bào Salmonella sp. và Staphylococcus aureus được nuôi cấy 
có thể phát hiện được bằng phản ứng multiplex PCR 
Mật độ tế bào Salmonella sp. (CFU/mL) 3×107 3×106 3×105 3×104 3×103 3×102 3×101 
Mật độ tế bào Staphylococcus aureus 
(CFU/mL) 
7×106 7×105 7×104 7×103 7×102 7×101 7 
Sản phẩm PCR gen invA + + + + + + - 
Sản phẩm PCR gen nuc + + + + + + - 
+: phản ứng dương tính; -: phản ứng âm tính. 
500 bp 
250 bp 
 g n Thành n ng Th i n Cao g n Kh nh inh 
32 
Hình 7. Kết quả điện di kiểm tra mật độ tế bào Salmonella sp. và Staphylococcus aureus 
được nuôi cấy có thể phát hiện được bằng phản ứng multiplex PCR. 
(M: thang chuẩn HypperLadder DNA 1 kb, giếng số 1: kiểm tra âm tính, 
giếng 2-8 tương ứng với nồng độ vi khuẩn Salmonella sp.) 
3.2.5. Đề xuất quy trình multiplex PCR 2 cặp mồi để phát hiện nhanh và đồng thời vi khuẩn 
Salmonella sp. và Staphylococcus aureus trong thực phẩm bằng gen invasive và gen 
nuclease 
Với các thông số được thiết lập và các khảo sát trên, quy trình multiplex PCR phát hiện 
đồng thời Salmonella sp. và Staphylococcus aureus trong thực phẩm được đề xuất như sau: 
với quy trình thực hiện phản ứng multiplex PCR 25 µL/30 chu kỳ nhiệt phản ứng với 1,5 µL 
10X PCR buffer, 1,5 µL MgCl2 25 mM, dNTPs 2,5 mM, 1 µL nồng độ mồi invA-F/R 
10 µM, 2 µL nồng độ mồi nuc-F/R 10 µM, 0,2 µL Taq Polymerase 5 U/mL, DNA khuôn 
10 µL (Hình 8). Chu trình nhiệt của phản ứng PCR bao gồm giai đoạn biến tính ban đầu (ở 
95 °C trong vòng 7 phút), giai đoạn khuếch đại 30 chu kỳ (biến tính 94 °C trong 30 giây, gắn 
mồi ở nhiệt độ 55 °C trong 30 giây, kéo dài mạch bổ sung ở 72 °C trong 30 giây), giai đoạn 
kéo dài cuối cùng (72 °C trong vòng 5 phút) và giai đoạn ủ, bảo quản (4 °C cho đến khi sử 
dụng sản phẩm). Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 1% trong dung dịch 
đệm TAE 0,5X ở hiệu điện thế 100V trong vòng 30 phút trên máy đọc Geldoc ở bước sóng 
312 nm. Kết quả điện di có thể khẳng định mẫu nhiễm Salmonella sp. khi kết quả điện di 
xuất hiện 1 vạch sản phẩm có kích thước 284 bp (giếng 2), mẫu nhiễm Staphylococcus 
aureus khi xuất hiện 1 vạch sản phẩm có kích thước 439 bp (giếng 1). Mẫu nhiễm cả vi 
khuẩn Salmonella sp. và Staphylococcus aureus khi xuất hiện đồng thời 2 vạch sản phẩm 
439 bp và 284 bp (giếng 4) và mẫu âm tính được đánh giá khi không xuất hiện vạch trên gel 
agarose điện di (giếng 3) (Hình 8). 
Hình 8. Kết quả của phản ứng multiplex PCR phát hiện đồng thời Salmonella sp. và Staphylococcus aureus. 
(M: thang chuẩn DNA 100 bp; giếng số 1: kết quả dương tính Staphylococcus aureus; 
giếng số 2: kết quả dương tính Salmonella sp.; giếng số 3: kết quả âm tính Salmonella sp.; 
giếng số 4: kết quả dương tính với Salmonella sp. và Staphylococcus aureus). 
500bp 
250bp 
 ghi n c và ng ng h ip C ong ph hiện vi h ẩn a on a p 
33 
4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 
Trong nghiên cứu này, việc xây dựng thành công quy trình phát hiện nhanh vi khuẩn 
Salmonella sp. và Staphylococcus aureus bằng kỹ thuật multiplex PCR đánh dấu bước đầu 
cho các kết quả và tiềm năng của nghiên cứu về sản xuất bộ kit thương mại định danh nhanh 
vi khuẩn gây bệnh trên các mẫu thực phẩm. Các thành phần phản ứng multiplex PCR với 
tổng thể tích là 25 µL gồm 2,5 µL PCR buffer 10X, 1,5 µL MgCl2 25 mM, 3 µL dNTPs 
2,5 mM; 1 µL mỗi mồi invA-F & invA-R ở nồng độ 10 mM; 2 µL mỗi mồi nucF ở nồng độ 
10 mM; 10 µL DNA khuôn và 1,8 µL H2O được tối ưu cho phản ứng đặc hiệu nhất. Điều 
kiện chu trình nhiệt của phản ứng multiplex PCR gồm 30 chu kỳ với giai đoạn biến tính ban 
đầu 95 °C trong vòng 7 phút; nhiệt độ biến tính ở 94 °C 30 giây, gắn mồi 53 °C trong 
45 giây, kéo dài mồi ở 72 °C trong 45 giây; pha kéo dài cuối cùng ở 72 °C trong 5 phút. Sản 
phẩm thu nhận được có thể khuếch đại 2 gen invasive và nuclease của 2 loài vi khuẩn. Tuy 
nhiên, sản phẩm vẫn chưa đồng nhất và độ dài của trình tự khá gần nhau gây khó khăn trong 
nhận diện các gen của vi khuẩn. Độ nhạy của phản ứng multiplex PCR ở 3 ×102 CFU/mL đối 
với Salmonella sp. và 70 CFU/mL đối với Staphylococcus aureus. Các điều kiện cho phản ứng 
multiplex PCR phát hiện Salmonella sp. và Staphylococcus aureus với nồng độ DNA khuôn 
của Salmonella sp. và Staphylococcus aureus được lựa chọn tương ứng là 1 × 10-4 ng/µL và 
6 × 10-8 ng/µL. Việc nghiên cứu thời gian tăng sinh cần thiết của các mẫu thực phẩm nhiễm 
Salmonella sp. và Staphylococcus aureus 1 CFU/ 25g mẫu sau 14 giờ tăng sinh có thể phát 
hiện bằng phương pháp multiplex PCR với hai cặp mồi invAF-invAR và nucF-nucR. Việc 
tiếp tục thử nghiệm quy trình multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Salmonella sp. và 
Staphylococcus aureus trên nhiều mẫu thực phẩm để xây dựng quy trình kiểm định bằng 
KIT thử nghiệm phát hiện nhanh và đồng thời Salmonella sp. và Staphylococcus aureus cần 
được triển khai mức độ đánh giá độ đặc hiệu ở ngưỡng nghiên cứu tế bào và hàm lượng 
DNA tới hạn của các loài vi khuẩn gây bệnh. Bên cạnh đó, việc đánh giá các đặc hiệu của 
nghiên cứu này cho các nhóm vi khuẩn khác trong nhóm vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm 
cũng cần được phát triển ở những nghiên cứu rộng rãi và đa dạng về các loại thực phẩm dễ 
tạp nhiễm khi triển khai thực hiện phản ứng multiplex PCR. Việc chọn lựa các cặp mồi có 
những phản ứng đặc hiệu hơn và có kích thước nhận diện dễ dàng hơn cần được đánh giá 
trong các nghiên cứu về sau. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Cục vệ sinh an toàn thực phẩm, Bộ Y tế - Báo cáo tình hình Vệ sinh an toàn thực 
phẩm, 2018. 
2. Nguyễn Tuấn Anh – Bước đầu nghiên cứu xây dựng phương pháp phát hiện nhanh 
bệnh tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) bằng kỹ thuật PCR, Đại học Nông Lâm 
(2015). 
3. Kumar S., Balakrishna K. & Batra H. - Detection of Salmonella enterica serovar Typhi 
(S. Typhi) by selective amplification of invA, viaB, fliC‐ d and prt genes by 
polymerase chain reaction in mutiplex format, Letters in Applied Microbiology 42 (2) 
(2006) 149-154. 
4. De Freitas C. G., Santana A. P., Silva P. H., Golcalves V. S., BarrosMde A., Torres F. 
A., Murata L. S., Perecmanis S. - PCR multiplex for detection of Salmonella enteritidis 
and typhymirium and occurrence in pourtry meat, International Journal of Food 
Microbiology 139 (1) (2010) 15-22. 
5. Trần Thị Xuân Mai, Võ Thị Thanh Phương, Trần Thị Hoàng Yến & Nguyễn Văn Bé - 
Phát hiện nhanh Salmonella spp., Salmonella enterica hiện diện trong thực phẩm bằng 
 g n Thành n ng Th i n Cao g n Kh nh inh 
34 
kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR), Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ 20b (2011) 
198-208. 
6. Lee, S. H., Jung, B.Y., Rayamahji, N. Lee, H.S., Jeon W.J, Kweon, K.H & Yoo, H.S. - 
A multiplex real-time PCR for differential detection and quantification of Salmonella 
spp., Salmonella enterica serovar typhimurium and enteritidis in meats, Journal of Vet 
Sciences 10 (1) (2009) 43-51. 
7. Meng, J., Zhao, S., Doyle, M. P., Mitchell, S. E. & Kresovich, S. - Polymerase chain 
reaction for detecting Escherichia coli O157: H7, International Journal of Food 
Microbiology 32 (1-2) (1996) 103-113. 
8. Garrido A., Chapela M. J., Roman B., Fajardo P., Lago J., Vieites J. M. & Cabado, 
A.G. - A new multiplex real-time PCR developed method for Salmonella spp. 
and Listeria monocytogenes detection in food and environmental samples, Food 
Control 30(1) (2013) 76-85. 
9. Rahn, K., De Grandis, S. A., Clarke, R. C., McEwen, S. A., Galan, J. E., Ginocchio, 
C., Curtiss III R. & C. L. Gyles - Amplification of an invA gene sequence of 
Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of 
detection of Salmonella, Molecular and Cellular Probes 6 (4) (1992) 271-279. 
10. Chiang, Y.-C., Yang, C.-Y., Li, C., Ho, Y.-C., Lin, C.-K. & Tsen, H.-Y. - 
Identification of Bacillus spp., Escherichia coli, Salmonella spp., Staphylococcus spp. 
and Vibrio spp. with 16S ribosomal DNA-based oligonucleotide array hybridization, 
International Journal of Food Microbiology 107 (2) (2006) 131-137. 
11. Sasaki, T., S. Tsubakishita, Y. Tanaka, A. Sakusabe, M. Ohtsuka, S. Hirotaki, T. 
Kawakami, T. Fukata and K. Hiramatsu - Multiplex-PCR method for species 
identification of coagulase-positive Staphylococci, Journal of clinical microbiology 48 
(3) (2010) 765-769. 
12. Pui, C. F., Wong, W. C., Chai, L. C., Lee, H. Y., Noorlis, A., Zainazor, T. C. T., Tang, 
J. Y. H., Ghazali, F. M., Cheah, Y. K. & Nakaguchi, Y. - Multiplex PCR for the 
concurrent detection and differentiation of Salmonella spp., Salmonella typhi and 
Salmonella typhimurium, Tropical Medicine and Health 39 (1) (2011) 9-15. 
13. Le Loir Y., Baron F. & Gautier M. - Staphylococcus aureus and food poisoning, 
Genetics Molecular Research 2 (1) (2003) 63-76. 
14. Normanno G., Firinu A., Virgilio S., Mula G., Di Giannatale D., Salinetti A. P., 
Salandra G. L., Bartoli M., Zuccon F., Pirino T., Sias S., Parisi A., Quaglia N. C. & 
Celano G. V. - Coagulase-positive Staphylococci and Staphylococcus aureus in food 
products marketed in Italy, International Journal of Food Microbiology 98(1) (2005) 
73-79. 
 ghi n c và ng ng h ip C ong ph hiện vi h ẩn a on a p 
35 
ABSTRACT 
STUDY OF MOLECULAR IDENTIFICATION USING MULTIPLEX PCR 
IN Salmonella sp. & Staphylococcus aureus DIAGNOSTICS 
CAUSING FOOD POISONING DISEASES 
Nguyen Thanh Luan*, Luong Thi Hieu, Cao Nguyen Khanh Linh 
Ho Chi Minh City University of Food Industry 
*Email: luannt@cntp.edu.vn 
The identification of infectious and opportunistic microorganism has recently been 
based on traditional culturing with low and cost effective, time controlling and hard 
manipulation for users and agencies. The new era of gene techniques that applied on 
observing, patrolling bacterial contamination to take minor times for prevention and medical 
cures have been considered as essential needs. The discovery of multiplex PCR could be 
applied in medical diagnostic because of quick returns, high sensitivity and parallel 
amplification of DNA bacteria for PCR results. This study indicates that the successful 
process of quick PCR amplification using multiplex PCR have been introduced for 
Salmonella sp. and Staphycoccus aureus. The optimal reaction of PCR have been chosen at 
the total volume of 25 µL with 2.5 µL 10X PCR buffer, 1.5 µL MgCl2 25 mM, 3 µL dNTPs 
2.5 mM; 1 µL of invAF/R, 2.0 µL each primer of nucF/R respectively, 10 µL DNA templates 
và 1.8 µL dilution H2O. The highest sensitivity of multiplex PCR also showed and complied 
at 300 CFU/mL for Salmonella sp. and 70 CFU/mL for Staphylococcus aureus test. The 
essential time for poisonous sample culturing (1 CFU/25g sample) required at least 14 hours 
of growing culture in medium. The specific evaluation of this study for the other bacteria has 
been considered in larger scale from different types of foods and sources when applying 
multiplex PCR. 
Keywords: Multiplex PCR, food poisoning, Salmonella sp., Staphylococcus aureus, invA, 
nuclease.