Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa cho Enzyme Acetylcholinesterase trong hệ biểu hiện E.coli

Hóa học & Kỹ thuật môi trường 
N. N. Hoa, , P. K. Cường,“Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa  hệ biểu hiện E.coli.” 194 
NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO ENZYME 
ACETYLCHOLINESTERASE TRONG HỆ BIỂU HIỆN E.coli 
Nghiêm Ngọc Hoa1, Đặng Thị Quỳnh1, Phạm Thị Thu Hường2, 
Nguyễn Thị Vân Anh2, Tô Văn Thiệp1, Nguyễn Văn Hoàng1, Phạm Kiên Cường1*. 
Tóm tắt: Acetylcholinesterase (AChE) là một enzyme quan trọng tham gia vào hệ 
thống dẫn truyền tín hiệu thần kinh, có mặt rộng rãi ở hầu hết các loài động vật. 
Chức năng chính của AChE là giới hạn tác dụng truyền đạt xung thần kinh tại vị trí 
các khớp thần kinh. Điều này được thực hiện nhờ quá trình thủy phân Acetylcholine 
dưới sự xúc tác của AChE, tạo thành Choline (ChOH) và axit axetic. Ứng dụng quan 
trọng của AChE là dùng để sản xuất ra các phương tiện phát hiện nhanh thuốc trừ 
sâu bảo vệ thực vật họ phospho hữu cơ trong môi trường, nông sản, rau quả. Trong 
nghiên cứu này, gen mã hóa cho acetylcholinesterase đã được nhân bản bằng PCR 
và nhân dòng vào vector pTOP-TA-V2 để tạo ra vector nhân dòng pTOP-AChE. 
Tiếp theo, gen mã hóa enzyme AChE từ vector pTOP-AChE được chuyển vào vector 
biểu hiện pET43a, để tạo ra vector biểu hiện pET43a-AChE. Vector này được biến 
nạp vào chủng E.coli DH5α tạo nên dạng tái tổ hợp DH5α-pET43a-AchE. Sự biểu 
hiện của gen mã hóa enzyme AchE đã được kiểm tra bằng phương pháp điện di và 
thẩm tích miễn dịch. 
Từ khóa: Acetylcholinesterase, Biểu hiện, Tái tổ hợp. 
1. MỞ ĐẦU 
Acetylcholinesterase là một enzyme quan trọng tham gia vào hệ thống dẫn 
truyền tín hiệu thần kinh, có mặt rộng rãi ở hầu hết các loài động vật [10, 11, 13]. 
Chức năng chính của enzyme acetylcholinesterase là giới hạn tác dụng truyền đạt 
xung thần kinh tại vị trí các khớp thần kinh [11]. Một trong những ứng dụng quan 
trọng của enzyme acetylcholinesterase là dùng để sản xuất ra các phương tiện phát 
hiện nhanh nhóm chất độc thần kinh, thuốc trừ sâu bảo vệ thực vật họ phospho hữu 
cơ [7]. Do có nhiều ứng dụng trong đời sống, trên thế giới, AChE được nghiên cứu 
tách chiết từ rất sớm. Để đạt được độ tinh sạch và hoạt độ phù hợp cho các mục 
đích khác nhau, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu tinh sạch enzyme AChE 
từ các nguồn khác nhau [3-6]. Tuy nhiên việc tách chiết enzyme 
acetylcholinesterase bằng các quy trình khác nhau đều có những hạn chế nhất định 
về hiệu suất, hoạt độ riêng. Một số nhược điểm như độ ổn định thấp, phụ thuộc 
nhiều vào nguồn nguyên liệu, nên khó sản xuất với quy mô lớn. Do đó, các nhà 
khoa học đã tập trung nghiên cứu biểu hiện enzyme acetylcholinesterase dưới dạng 
tái tổ hợp nhằm thu nhận được một lượng lớn dùng cho mục đích phân tích hoặc trị 
liệu cũng như nghiên cứu [8, 12, 14]. 
Ở Việt Nam, chưa có nhiều công trình nghiên cứu sản xuất enzym 
eacetylcholinesterase tái tổ hợp. Một số công trình nghiên cứu chủ yếu tập trung 
vào việc tách chiết enzyme này từ các nguồn tự nhiên (thực vật, động vật và vi 
sinh vật), khảo sát các tính chất lý-hóa và hoạt tính sinh học của chúng [1, 2]. 
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nhân dòng gen mã hóa cho enzyme AChEvào 
vector pET43a và biểu hiện ở E. coli. 
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 
2.1. Nguyên liệu và hóa chất 
Nghiên cứu khoa học công nghệ 
Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 54, 04 - 2018 195
Chủng E. coli DH5α, BL21 (DE3) RIL được mua từ hãng Invitrogen. 
Hỗn hợp dNTP, thang chuẩn DNA được mua từ hãng Thermofisher; Taq 
DNA polymerase,enzyme giới hạn được mua từ hãng Enzynomics, T4 DNA ligase 
của hãng Promega, bộ kit tinh sạch plasmid của hãng Bioneer và kit đọc trình tự 
của hãng Beckman Coulter. 
Các hóa chất còn lại đều đạt độ tinh sạch dành cho phân tích và được mua từ 
các hãng tin cậy (Sigma, Merk). 
2.2. Thiết bị 
Máy PCR( Bio – Rad, Singapore), máy điện di (Cleaver - Anh), hệ thống phân 
tích hình ảnh (Biorad – Italia), máy đo quang phổ Halo RB (RB – 10), máy ly tâm 
lạnh (Sigma – Đức), tủ ấm (Memer – Đức), máy đo pH (Mettle toledo), máy lắc 
(Big bill, Mĩ). 
2.3. Phương pháp, kĩ thuật nghiên cứu 
2.3.1. Xác định hàm lượng protein 
Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp đo mật độ quang ở bước 
sóng λ=280 nm và theo phương pháp của Lowry và cộng sự [9] với tinh thể 
albumin huyết thanh bò làm đường chuẩn. 
2.3.2. Xác định hoạt độ Acetylcholinesterase 
Hoạt tính của Acetylcholinesterase được xác định theo Kit của Biovision. Một 
đơn vị hoạt tính được xác định là lượng enzyme cần thiết để thủy phân 1µmol cơ 
chất ACh trong 1 phút ở 370C với chất chỉ thị màu AChE probe, đo ở bước sóng 
λ= 570 nm. 
2.3.3. Nhân dòng đoạn gen mã hóa enzyme acetylcholinesterase 
Gen mã hóa cho enzyme acetylcholinesterase được nhân bản trực tiếp 
bằngphương pháp PCR. Đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR này có chứa 
trình tự nhận biết của enzyme EcoRI (AChE-Fw:5’-
TGGACCGAATTCATGAGGCCCCCGTGGTGTC-3’) và enzyme XhoI (AChE-
Rv:5’-GTGGTGCTCGAGTCACAGGTCTGAGCAGCGATCC-3’) 
PCR chứa 1xTaq polymerase buffer, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, và 2,5 
đơn vị Taqpolymerase với tổng thể tích cuối là 25 µl. Quá trình nhân bản được 
tiến hành bởi máy GeneAmp PCRSystem 9700 với 1 vòng ở 95oC trong 5 phút 
để khởi động nóng, tiếp theo là 35 chu kì gồm 30 giâyở 95oC, 45 giâyở 60oC, và 
2 phút ở 72oC, tiếp theo là kéo dài ở 72oC trong 7 phút và bảo quản ở 4oC cho 
đến khi sử dụng. 
Sản phẩm PCR sau khi được tạo thành được gắn vào vector pTOP-TA-V2 nhờ 
kit ligase (kit TOP cloner TMTA core), và được biến nạp vào E. coli DH5α. Các 
khuẩn lạc dương tính mang vector nhân dòng được phát hiện bằng phương pháp 
PCR sử dụng trực tiếp khuẩn lạc làm nguồn cho DNA khuôn với cặp mồi đặc hiệu 
cho đoạn gen AChE (AChE Fw, AChE Rv). Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng 
điện di trên gel agarose 1%. Trình tự nucleotide được xác định theo phương pháp 
Sanger trên máy đọc trình tự CEQ 8000 (Beckman Coulter). 
2.3.4. Biểu hiện gen mã hóa enzyme acetylcholinesteraseở E. coli 
Plasmid tái tổ hợp pTOP mang gen mã hóa enzyme acetylcholi