Tuyển chọn và nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp protease của ba chủng Bacillus phân lập từ mắm cá

JOURNAL OF SCIENCE OF HNUE DOI: 10.18173/2354-1059.2015-00015 
Natural Sci. 2015, Vol. 60, No. 4, pp. 106-113 
This paper is available online at  
Ngày nhận bài: 13/4/2015. Ngày nhận đăng: 2/5/2015. 
Tác giả liên lạc: Đoàn Văn Thược, địa chỉ e-mail: doanvanthuoc@yahoo.com 
106 
TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP 
PROTEASE CỦA BA CHỦNG Bacillus PHÂN LẬP TỪ MẮM CÁ 
Đoàn Văn Thược và Vũ Thị Thu Hiền 
Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 
Tóm tắt. Từ mẫu mắm cá đang lên men chúng tôi đã phân lập được 104 chủng vi khuẩn. Trong 
số đó có 51 chủng thể hiện hoạt tính protease khi nuôi trên môi trường MPA1 có bổ sung 1% 
gelatin. Ba chủng vi khuẩn (Tp91, Tp97, Tp98) có khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp 
protease trên các môi trường chứa các nồng độ NaCl khác nhau từ 0 - 21% đã được lựa chọn để 
nghiên cứu. Bằng kĩ thuật di truyền phân tử chúng tôi đã định tên 3 chủng vi khuẩn tuyển 
chọn là Bacillus sp. Tp91, Bacillus sp. Tp97 và Bacillus sp. Tp98. Ba chủng này đều sinh trưởng 
và sinh tổng hợp protease tốt nhất sau 24 h nuôi cấy ở 37 oC tốc độ 200 vòng/phút. Hoạt tính 
protease cực đại của 3 chủng Bacillus sp. Tp91, Bacillus sp. Tp97 và Bacillus sp. Tp98 lần lượt là 
1045, 860 và 630 U/mL. Ngoài khả năng sinh tổng hợp protease cao, ba chủng Bacillus còn có 
khả ức chế một số vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa thường gặp như Vibrio parahaemolyticus, V. 
furnissii, Escherichia coli, Salmonella choleraesuis. Ba chủng Bacillus có những tiêu chuẩn cần 
thiết để có thể ứng dụng trong quy trình sản xuất nước mắm. 
Từ khóa: Nước mắm, Bacillus, protease. 
1. Mở đầu 
Ở Việt Nam, nước mắm là sản phẩm truyền thống, được sản xuất từ lâu đời. Ngày nay, nước 
mắm không chỉ được sản xuất để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ở trong nước mà còn được xuất khẩu sang 
nhiều nước trên thế giới. Nước mắm sản xuất theo phương pháp lên men truyền thống thường mất 
nhiều thời gian nên lợi nhuận thấp và khó đáp ứng nhu cầu sử dụng ngày càng lớn trên thị trường [1, 2]. 
Vì vậy, để tăng lợi nhuận cho người sản xuất đồng thời để đáp ứng nhu cầu sử dụng nước mắm ngày 
càng tăng thì cần có biện pháp rút ngắn thời gian sản xuất. Quá trình làm mắm có thể rút ngắn bằng 
cách điều chỉnh pH, nồng độ muối và nhiệt độ trong quá trình lên men. Sự điều chỉnh này với mục 
đích tối ưu hoá hoạt động của protease do vi khuẩn trong ruột cá sinh ra [3]. Một cách khác để rút 
ngắn quá trình sản xuất nước mắm là bổ sung protease hoặc vi khuẩn sinh tổng hợp protease để làm 
tăng tốc độ thủy phân protein [1, 2, 4, 5]. Kết quả các nghiên cứu gần đây của Yongsawatdigul và 
cộng sự cho thấy, sự bổ sung vi khuẩn sinh protease chịu mặn đã rút ngắn quá trình sản xuất nước 
mắm mà vẫn giữ được chất lượng nước mắm [5]. 
Tuyển chọn và nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp protease của ba chủng Bacillus phân lập từ mắm cá 
107 
Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành phân lập vi khuẩn từ mắm cá đang lên men, tuyển chọn 
chủng vi khuẩn có khả năng sinh protease mạnh ở các nồng độ muối khác nhau để định hướng ứng 
dụng trong quá trình làm mắm nhằm rút ngắn thời gian sản xuất. 
2. Nội dung nghiên cứu 
2.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 
* Vật liệu nghiên cứu 
Các mẫu mắm cá đang lên men được lấy từ làng sản xuất nước mắm Sa Châu thuộc xã Giao 
Châu, huyện Giao Thủy, tỉnh Nam Định. 
* Môi trường dinh dưỡng sử dụng trong nghiên cứu 
Môi trường phân lập vi khuẩn và giữ giống vi khuẩn là môi trường MPA cải tiến (viết tắt là 
MPA1). Thành phần môi trường gồm: cao thịt, 5g; pepton, 5g; NaCl, 50g; agar, 20g; nước cất, 1000 
mL; pH 7,0. 
* Phương pháp phân lập vi sinh vật 
Pha loãng 1g mắm cá vào nước vô trùng có chứa 5% NaCl để đạt đến các độ pha loãng 5 x 10-3, 5 
x 10-4, 5 x 10-5, 5 x 10-6. Hút 100µl dịch ở các nồng độ pha loãng nhỏ vào chính giữa đĩa môi trường 
dùng để phân lập, dùng que trang gạt đều. Sau 48 h ủ ở 37 oC dùng tăm cấy chuyển các khuẩn lạc vào 
môi trường giữ giống để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. 
* Phương pháp lên men vi sinh vật 
Cấy các chủng vi khuẩn đã được hoạt hóa vào bình tam giác 100 mL có chứa 25 mL môi trường 
lỏng, nuôi ở 37 oC với tốc độ lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ (giống cấp 1). Hút và bổ sung 2.5% 
giống cấp 1 vào bình tam giác 100 mL chứa 25 mL môi trường thí nghiệm dạng lỏng. Tiến hành nuôi 
lắc ở điều kiện 37 oC với tốc độ lắc 200 vòng/phút. Dịch lên men được thu lại ở các thời điểm khác 
nhau để xác định hoạt tính enzyme và mật độ tế bào. 
* Phương pháp tách chiết DNA tổng số và giải trình tự gen 16S rRNA 
Nuôi cấy chủng tuyển trọn trên môi trường MPA1 lỏng ở 37 oC trong 13 h. Tách DNA tổng số 
bằng bộ kit ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM (Mỹ). Khuếch đại trình tự gen 16S rRNA bằng 
phản ứng PCR sử dụng cặp mồi gồm: 
- Mồi xuôi: 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) 
- Mồi ngược 1492R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’). 
Chu trình nhiệt cho phản ứng: biến tính ở 95 oC trong 3 phút; lặp lại 30 chu kì (95 oC trong 30 
giây, 55 oC trong 30 giây và 72 oC trong 1.5 phút); 72 oC trong 10 phút và 4 oC cho để bảo quản. Sản 
phẩm PCR sau đó được gửi sang công ty Bioneer (Hàn Quốc) để giải trình tự. Trình tự nucleotide thu 
được sẽ được so sánh với trình nucleotide có trên ngân hàng gen để định tên chủng vi khuẩn. 
* Phương pháp thử khả năng đối kháng vi sinh vật 
Khả năng đối kháng của ba chủng tuyển chọn với các vi sinh vật kiểm định (Vibrio sp., 
Escherichia coli hay Salmonella sp.) thu nhận từ Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương được xác định theo 
phương pháp đột thạch nhỏ dịch [6]. 
* Phương pháp xác định hoạt tính 
Hoạt tính protease được xác định sơ bộ bằng phương pháp cấy chấm điểm và kiểm tra vòng phân 
giải bằng dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa [6]. 
Hoạt tính của enzyme cũng được xác định bằng phương pháp định lượng theo Nguyễn Văn Mùi 
(2007) [7]. 
Đoàn Văn Thược và Vũ Thị Thu Hiền 
108 
2.2. Kết quả và thảo luận 
2.2.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào 
Từ mẫu mắm lên men lấy từ xã Giao Châu, huyện Giao Thủy, tỉnh Nam Định, tiến hành pha 
loãng và phân lập các chủng vi khuẩn trên môi trường MPA1. Sau 48 h ủ ở 37 oC chúng tôi đã thu 
được 104 khuẩn lạc vi khuẩn được kí hiệu Tp1 - Tp104. Những khuẩn lạc này đã được cấy tách sang 
môi trường MPA1 mới sau đó thử nghiệm khả năng sinh protease ngoại bào bằng phương pháp cấy 
chấm điểm trên môi trường MPA1 có bổ sung 1% gelatin. Kết quả cho thấy có 51 chủng (49%) có khả 
năng sinh protease ngoại bào trong đó có 4 chủng có đường kính vòng phân giải gelatin lớn hơn 2 cm, 
25 chủng có vòng phân giải từ 1,5 đến 2 cm, và 22 chủng có vòng phân giải nhỏ hơn 1,5 cm. Chúng 
tôi đã chọn 29 chủng có vòng phân giải gelatin lớn hơn 1,5 cm để tiến hành nghiên cứu tuyển chọn lần hai. 
2.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp protease 
Một tiêu chí quan trọng trong lựa chọn các chủng vi khuẩn để ứng dụng trong công nghiệp sản 
xuất nước mắm là có khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp protease trong điều kiện mặn cao [2, 3, 5]. 
Vì vậy chúng tôi đã cấy chấm điểm 29 chủng lựa chọn ở trên vào môi trường MPA1 có chứa 1% 
gelatin và các nồng độ NaCl khác nhau (từ 0 đến 21%). Kết quả nghiên cứu cho thấy tất cả các chủng 
vi khuẩn nghiên cứu đều sinh trưởng và sinh tổng hợp protease mạnh nhất trên môi trường không bổ 
sung NaCl hoặc bổ sung NaCl ở nồng độ thấp, khi nồng độ NaCl trong môi trường tăng cao thì khả 
năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme cũng giảm. Trong số 29 chủng thử nghiệm có 16 chủng có 
vòng phân giải protein trên các môi trường có bổ sung NaCl từ 0% tới 21%; 5 chủng có vòng phân 
giải trên môi trường bổ sung NaCl từ 0% tới 18%; 2 chủng có vòng phân giải trên các môi trường bổ 
sung NaCl từ 0% tới 15%; 6 chủng còn lại có vòng phân giải trên môi trường bổ sung NaCl từ 0% tới 
12%. Ba chủng vi khuẩn (ký hiệu là Tp91, Tp97 và Tp98) có khả năng sinh tổng hợp protease mạnh 
trên các nồng độ muối khác nhau đã được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu (Hình 1 và Bảng 1). 
Hình 1. Vòng phân giải gelatin của 4 chủng vi khuẩn 
(Tp95, Tp96, Tp97, Tp98) ở nồng độ muối 18% 
Tuyển chọn và nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp protease của ba chủng Bacillus phân lập từ mắm cá 
109 
Bảng 1. Khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp protease của ba chủng vi khuẩn 
 tuyển chọn trên môi trường có các nồng độ muối khác nhau 
Tên 
chủng 
Đường 
kính 
(cm) 
Nồng độ NaCl 
0% 3% 6% 9% 12% 15% 18% 21% 
Tp91 
d 1,25 0,4 0,4 0,3 0,1 0,1 0,1 0,1 
D 3,45 2,7 2,45 2,0 1,3 0,6 0,55 0,6 
Tp97 
d 1,9 0,45 0,48 0,4 0,1 0,1 0,1 0,1 
D 3,55 2,65 2,45 2,05 1,4 1,1 1,15 0,95 
Tp98 
d 1,35 0,4 0,4 0,4 0,1 0,1 0,1 0,1 
D 3,45 3,2 3,15 2,9 1,75 1,7 1,35 1,4 
(d) đường kính khuẩn lạc, (D) đường kính vòng phân giải. 
2.2.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào, định danh 3 chủng tuyển chọn bằng kĩ thuật 
di truyền phân tử 
Khuẩn lạc của 3 chủng tuyển chọn đều có màu trắng ngà, bề mặt trơn bóng và hơi nhăn ở chính 
giữa khuẩn lạc. Tế bào của cả ba chủng đều có dạng trực khuẩn, gram dương, có bào tử ở chính giữa tế 
bào, tế bào đứng rời hay từng đôi một (Hình 2A, B, C). 
Sau khi tách chiết DNA tổng số của 3 chủng tuyển chọn và chạy PCR chúng tôi đã thu được các 
đoạn gen có kích thước hơn 1400 bp, các đoạn gen này đã được gửi sang Hàn Quốc giải trình tự. So 
sánh trình tự gen 16S rRNA của ba chủng tuyển chọn (phụ lục) với các trình tự gen trong ngân hàng 
gen thế giới chúng tôi nhận thấy: trình tự gen 16S rRNA của chủng Tp91 và chủng Tp97 giống 100% 
so với trình tự gen của nhiều chủng Bacillus subtilis và một số chủng B. tequilensis, trong khi đó trình 
tự gen 16S rRNA của chủng Tp98 giống 100% so với trình tự gen của nhiều chủng B. subtilis và giống 
99% so với chủng B. tequilensis. Dựa vào các kết quả này chúng tôi đặt tên cho 3 chủng tuyển chọn 
lần lượt là Bacillus sp. Tp91, Bacillus sp. Tp97 và Bacillus sp. Tp98. 
Nhiều nghiên cứu trước kia đều nhận thấy Bacillus sp. là nhóm chịu và ưa mặn khá phổ biến 
trong các sản phẩm lên men từ thủy sản đặc biệt là trong giai đoạn đầu của quá trình lên men [3, 5]. 
Bacillus đóng vai trò quan trọng trong các quá trình lên men truyền thống do có khả năng phát triển ở 
dải pH rộng, sản xuất nhiều enzyme ngoại bào quan trọng. Rất nhiều loài Bacillus có khả năng sinh 
nhiều loại kháng sinh như subtilin, eumycin, bacilin, bacillomin nên có khả năng chống lại nhiều loại 
vi khuẩn có hại [8]. 
Hình 2. Hình dạng tế bào của chủng (A) Tp91, (B) Tp97 và (C) Tp98 
dưới kính hiển vi quang học (100X) 
Đoàn Văn Thược và Vũ Thị Thu Hiền 
110 
2.2.4. Sự sinh trưởng và sinh tổng hợp protease ở các thời điểm lấy mẫu khác nhau 
Hình 3. Mật độ tế bào và hoạt tính protease của chủng (A) Bacillus sp. Tp91, 
(B) Bacillus sp. Tp97 và (C) Bacillus sp. Tp98 ở các thời gian nuôi cấy khác nhau 
Tuyển chọn và nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp protease của ba chủng Bacillus phân lập từ mắm cá 
111 
Chúng tôi tiến hành lên men ba chủng Bacillus trên môi trường MPA1 lỏng ở 37oC, tốc độ lắc 
200 vòng/phút. Lấy mẫu tại các thời điểm khác nhau nhằm xác định ảnh hưởng của thời gian đến sự 
sinh trưởng và sinh tổng hợp protease của các chủng nghiên cứu. Kết quả cho thấy ở cả ba chủng 
nghiên cứu mật độ tế bào đạt cực đại sau 24 h nuôi cấy, sau đó mật độ tế bào vi sinh vật giảm dần theo 
thời gian nuôi cấy (Hình 3A, 3B, 3C). Tương ứng với sự sinh trưởng của vi sinh vật, hoạt tính emzyme 
cũng tăng theo thời gian nuôi cấy và đạt giá trị cực đại sau 24 h nuôi cấy. Hoạt tính protease cực đại 
của ba chủng Bacillus sp. Tp91, Bacillus sp. Tp97 và Bacillus sp. Tp98 lần lượt là 1045, 860 và 630 
U/mL. Sau 24h hoạt tính enzyme giảm do mật độ tế bào giảm, nhưng lại tăng lên ở 36h. Hoạt tính 
enzyme tăng lúc 36 h có thể là do các tế bào chết đã bị ly giải, khi đó protease nội bào được giải phóng 
ra môi trường. 
Kết quả của nghiên cứu này cũng tương tự như kết quả nghiên cứu trước đó của Sehar và 
Hameed (2011) đối với chủng vi khuẩn Bacillus sp. HS-4 phân lập được từ vùng đất mặn. Các kết quả 
nghiên cứu chỉ ra rằng thời điểm mật độ tế bào Bacillus sp. HS-4 đạt giá trị cực đại cũng là thời điểm 
hoạt tính protease đạt cực đại [9]. Tuy nhiên hoạt tính protease của ba chủng Bacillus phân lập được 
trong nghiên cứu này cao hơn nhiều so với hoạt tính protease của chủng Bacillus sp. HS-4 (295 
U/mL). 
2.2.5. Khả năng đối kháng của 3 chủng tuyển chọn với một số vi sinh vật có hại thường gặp 
Hầu hết các vi khuẩn có hại đều bị ức chế bởi nồng độ muối cao trong quá trình làm mắm. Tuy 
nhiên nồng độ muối cao trong mắm sẽ làm tăng thời gian sản xuất và làm giảm giá trị cảm quan của 
nước mắm, vì vậy muốn rút ngắn thời gian sản xuất và tăng giá trị cảm quan của nước mắm thì cần 
giảm nồng độ muối trong quá trình sản xuất. Tuy nhiên nếu giảm nồng độ muối thì các vi sinh vật gây 
hại sẽ có điều kiện phát triển và khi đó chất lượng mắm bị giảm [3]. 
Nghiên cứu tuyển chọn được chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp protease mạnh nhưng lại 
đối kháng với một số vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa phổ biến như Vibrio sp., Escherichia coli hay 
Salmonella sp. sẽ mang lại nhiều ý nghĩa cho ngành công nghiệp sản xuất nước mắm. Các chủng này 
khi được sử dụng làm giống khởi đầu cho quá trình làm mắm sẽ sinh tổng hợp protease để thủy phân 
protein của cá, đồng thời kháng lại sự phát triển của một số vi sinh vật có hại. Do đó có thể giảm được 
nồng độ muối và rút ngắn thời gian làm mắm nhưng vẫn tạo ra mắm sạch phù hợp với nhu cầu người 
tiêu dùng. Vì lí do trên chúng tôi đã khảo sát khả năng đối kháng của 3 chủng nghiên cứu đối với một 
số chủng vi sinh vật có hại thường gặp, kết quả được thể hiện trong Bảng 2 và minh họa trong Hình 4. 
Bảng 2. Khả năng đối kháng của 3 chủng tuyển chọn với một số vi khuẩn 
gây bệnh đường tiêu hóa thường gặp 
Chủng 
Các chủng vi sinh vật kiểm định 
V. parahaemolyticus V. furnissii V. cholerae E. coli Sal. choleraesuis 
Tp91 + + - + + 
Tp97 + + - + + 
Tp98 + + - + + 
Ghi chú: + đối kháng, - không đối kháng 
Đoàn Văn Thược và Vũ Thị Thu Hiền 
112 
Kết quả cho thấy ba chủng tuyển chọn đều có khả năng ức chế V. parahaemolyticus, V. furnissii, 
E. coli, Sal. choleraesuis, tuy nhiên cả ba chủng này đều không có khả năng ức chế V. cholerae. 
Hình 4. Vòng vô khuẩn thể hiện khả năng ức chế của 3 chủng tuyển chọn 
đối với (A) E. coli và (B) V. parahaemolyticus 
3. Kết luận 
Trong nghiên cứu này chúng tôi đã phân lập và tuyển chọn được 3 chủng vi khuẩn có khả năng 
sinh trưởng và sinh tổng hợp protease ở các nồng độ NaCl khác nhau từ 0 đến 21%. Ba chủng này đều 
thuộc chi Bacillus và được đặt tên là: Bacillus sp. Tp91, Bacillus sp. Tp97 và Bacillus sp. Tp98. Ngoài 
khả năng sinh tổng hợp protease cao, ba chủng Bacillus còn có khả năng ức chế sự sinh trưởng của 
một số vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa điển hình như V. parahaemolyticus, V. furnissii, E. coli và 
Sal. choleraesuis. Với khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp protease cao trên nhiều nồng độ NaCl 
khác nhau, đồng thời lại có khả năng ức chế một số loại vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa, ba chủng 
tuyển chọn có tiềm năng ứng dụng trong quy trình sản xuất nước mắm. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
[1] Vũ Ngọc Bội, 2004. Nghiên cứu quá trình thủy phân cá bằng enzyme protease từ B. subtilis 
S5. Luận án tiến sĩ Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh. 
[2] Nguyễn Văn Lâm, Nguyễn Phương Nhuệ, Trịnh Thị Ngọc, 2011. Phân lập và nghiên cứu vi 
khuẩn ưa muối ưa kiềm sinh protease và bước đầu thử nghiệm để sản xuất nước mắm ngắn 
ngày. Tạp chí Khoa học và Phát triển. 9(3) 452 – 463 
[3] B. J. B.Wood, 1998. Fermented fish and fish products (Microbiology of fermented foods). 
Blackie academic & professional. pp 416-434. 
[4] N. G. Sanceda, T. Kurata and N. Hamano, 1996. Accelerated fermentation process of 
manufacture of fish sauce using histidine. J. Food Sci. 61(1): 220-222. 
[5] J. Yongsawatdigul, S. Rodtong, and N. Raksakulthai, 2007. Acceleration of Thai fish sauce 
fermentation using proteinases and bacterial starter cultures. J. Food Sci. 72(9): 382-390. 
Tuyển chọn và nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp protease của ba chủng Bacillus phân lập từ mắm cá 
113 
[6] Mai Thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung, Vương Trọng Hào, 2011. Thực hành Vi sinh vật học. 
Nxb Đại học Sư phạm Hà Nội. tr 95-105. 
[7] Nguyễn Văn Mùi, 2007. Thực hánh Hóa sinh học. Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội. tr 74-76. 
[8] M. Schallmey, A Singh and O. P. Ward, 2004. Developments in the use of Bacillus species 
for industrial production. Can. J. Microbiol. 50(1): 1-17. 
[9] S. Sehar and A. Hameed, 2011. Extracellular alkaline protease by a newly isolated 
halophilic Bacillus sp. Global J. Biotech. Biochem. 6(3): 142-148. 
ABSTRACT 
Isolation and characterization of three protease producing Bacillus strains 
from fermented fish 
One hundred and four bacterial strains were isolated from fermented fish. Of these, 51 strains 
were found to produce extracellular protease. Three bacterial strains named Tp91, Tp97 and Tp98 
were able to grow and synthesize protease with high activity on mediums containing NaCl 
concentrations that ranged from 0 to 21percent. By using molecular genetic analysis, three bacterial 
strains were identified as Bacillus sp. Tp91, Bacillus sp. Tp97 and Bacillus sp. Tp98. Optimum 
biomass and proteolytic activity of the three Bacillus strains were achieved after 24 h of cultivation at 
37oC and 200 rpm agitation. Maximum proteolytic activity of the three Bacillus strains were 1045 
(Bacillus sp. Tp91), 860 (Bacillus sp. Tp97) and 630 U/mL (Bacillus sp. Tp98). Three Bacillus strains 
showed inhibitory activity against common gastroenteric bacteria such as Vibrio parahaemolyticus, 
V. furnissii, Escherichia coli and Salmonella choleraesuis. Three Bacillus strains can be used in fish 
sauce production. 
Key words: Fish sauce, Bacillus, peotease.