Kết quả nhân bản và xác định trình tự đoạn Epitope của gen mã hóa kháng nguyên Cyfra21-1

TẠP CHÍ KHOA HỌC, TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 24. 2015 
77 
KẾT QUẢ NHÂN BẢN VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ ĐOẠN 
EPITOPE CỦA GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN CYFRA21-1 
Lê Đình Chắc1 
TÓM TẮT 
Ung thư phổi là một trong những căn bệnh hiểm nghèo do sự tăng sinh không 
bình thường của tế bào , thường gặp ở nam giới , chủ yếu là lứa tuổi 50-70. Nghiên cứu 
nguồn gốc và sự phát triển của tế bào ung thư phổi dạng không phải tế bào nhỏ, người 
ta nhận thấy ung thư có liên quan chặt chẽ với sự xuất hiện hàm lượng kháng nguyên 
đặc trưng CYFRA21-1 trong máu, nước mô, huyết thanh. Do vậy việc tìm và xác định 
được trình tự gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 là cần thiết, làm cơ sở cho việc 
biểu hiện, thu protein CYFRA21-1 tái tổ hợp để phục vụ cho việc tạo KIT chẩn đoán 
sớm ung thư phổi dạng không phải tế bào nhỏ đem lại cơ hội sống cho bệnh nhân. 
Trong nghiên cứu này, trình tự nucleotide, trình tự amino acicid đoạn epitope 
của gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 đã được nhân bản và xác định trình tự với 
sự tương đồng là 100% với trình tự amino acid trên Ngân hàng dữ liệu quốc tế mang 
mã số K1C19- HUMAN-P08727. 
Từ khóa: Ung thư phổi, gen mã hóa, CYFRA21-1,K1C19- HUMAN-P08727. 
1. ĐẶT VẤN ĐỀ 
Ung thƣ phổi (UTP) là một trong nhƣ̃ng căn bệnh hiểm nghèo do sƣ̣ tăng sinh 
không bình thƣờng của tế bào , thƣờng gặp ở nam giới , chủ yếu là lứa tuổi 50-70, đặc 
biệt liên quan đến những ngƣời đã hoặc đang hút thuố c lá. Đồng thời, UTP cũng là căn 
bệnh có tỉ lệ tử vong lớn thƣờng gặp ở ngƣời . Vì vậy, việc phát hiện sớm UTP có ý 
nghĩa sống còn với bệnh nhân. 
Thực tế, trong y học đã có rất nhiều phƣơng pháp đƣợc sử dụng để chẩn đoán 
UTP (sinh thiết phổi, nội soi phổi, thử đờm, chọc nƣớc màng phổi, chụp quang tuyến 
cắt lớp ) và một số phƣơng pháp điều trị UTP (hóa trị liệu, phẫu thuật, xạ trị ) [1]. 
Tuy nhiên, khi phát hiện UTP thì thƣờng đã muộn hoặc quá muộn, vì một số căn bệnh 
khác (viêm phế quản, viêm phổi, lao, ) cũng có những triệu chứng tƣơng tự UTP. 
Nghiên cứu tế bào ung thƣ cũng nhƣ nguồn gốc và sự phát triển của tế bào ung 
thƣ, ngƣời ta nhận thấy ung thƣ có liên quan chặt chẽ với sự xuất hiện hàm lƣợng các 
kháng nguyên đặc trƣng ung thƣ trong máu, nƣớc mô, huyết thanh [2], [5], [6]. Điều 
này đã mở ra hƣớng nghiên cứu mới trong chẩn đoán và điều trị ung thƣ trên thế giới 
và trong nƣớc. 
1
 TS. Giảng viên khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại học Hồng Đức 
TẠP CHÍ KHOA HỌC, TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 24. 2015 
78 
Hiện nay, nhiều chỉ thị kháng nguyên ung thƣ đƣợc biết đến và có thể sƣ̉ dụng để 
phát hiện ung thƣ nhƣ : CEA, NES, CA125, CYFRA21-1, HER-2/neu  [10], [12], 
[13], [14], [15] trong đó, kháng nguyên CYFRA21-1 là một chỉ thị điển hình cho bệnh 
UTP dạng không phải tế bào nhỏ (non small cell lung carcinoma - NSCLC) do sự tăng 
hàm lƣợng CYFRA21-1 nhanh chóng trong dịch cơ thể khi tế bào biểu mô phổi tăng 
sinh bất thƣờng [2], [3], [7], [8], [11]. Vì vậy, phát hiện sớm đƣợc sự tăng hàm lƣợng 
CYFRA21-1 trong máu sẽ góp phần chẩn đoán sớm đƣợc UTP và kháng nguyên 
CYFRA21-1 có thể đƣợc sử dụng nhƣ là một chỉ thị đặc hiệu để chẩn đoán sớm, từ đó 
định hƣớng điều trị hiệu quả UTP dạng NSCLC. 
Việc nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp CYFRA21-1 trong UTP là một 
trong những hƣớng nghiên cứu mới nhằm xây dựng bộ KIT chẩn đoán, theo dõi và 
định hƣớng điều trị kịp thời bệnh UTP dạng NSCLC, góp phần vào những thành tựu 
đáng kể trong y học và sinh học. 
Trong bài viết này, chúng tôi trình bày kết quả của việc nhân bản và tách dòng 
đoạn epitop của gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 làm tiền đề cho các nghiên 
cứu tiếp theo. 
2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 
- Gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 (Phòng thí nghiệm trọng điểm công 
nghệ gen tế bào Động vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) cung cấp. 
- Cặp mồi sử dụng để biểu hiện đoạn gen mã hóa epitope kháng nguyên 
CYFRA21-1 
ExpcyF: 5‟ -CATATGGGCAGGTC-3‟ 
ExpcyR: 5‟-CTCGAGGTCCATGAGCCGCTGGTAC-3‟ 
- Vector tách dòng PCR2.1-TOPO do hãng Invitrogen cung cấp. Cặp mồi 
M13F/M13R để xác định đoạn gen CYFRA21-1 có trong E. coli có trình tự nhƣ sau: 
M13F: 5‟-GTAAAACGACGGCCAG-3‟ 
M13R: 5‟-CAGGAAACAGCTATGAC-3‟ 
- Dòng tế bào E. coli DH5α do Trung tâm Công nghệ Protein của Vƣơng Quốc 
Anh (MRC-Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) cung cấp. Cặp mồi 
LabF/R dùng để nhân bản, khuếch đại thƣ viện thực khuẩn sau mỗi vòng sàng lọc, trình 
tự cụ thể nhƣ sau: 
LabF: 5‟-CAGGAACAGCTATGAC- 3‟ 
LabR: 5‟-GAATTTTCTGTATGAGG- 3‟ 
- Helper phage M13K07 (Invitrogen, CA, USA). 
- Bộ KIT tách dòng “TA-Topo Cloning KIT; KIT tách plasmid từ vi khuẩn của 
hãng QIAgen; KIT real time-PCR của Roche; KIT tinh sạch thu đoạn DNA từ gel 
agarose của hãng Bioscience; KIT Big Dye Terminator sequencing ”. 
TẠP CHÍ KHOA HỌC, TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 24. 2015 
79 
- Các enzym: Taq DNA polymease, Nde I, EcoR I, Xho I, T4 DNA, ligase,  Các 
sinh phẩm này do hãng BioLabs cung cấp. 
3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
Để thực hiện thành công việc nhân bản và tách dòng đoạn epitop của gen mã hóa 
kháng nguyên CYFRA21-1, chúng tôi sử dụng một số các phƣơng pháp sau: 
3.1. Phƣơng pháp nhân bản gen bằng PCR 
Thành phần phản ứng PCR 
Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích(µl) 
Dung dịch đệm 10X 2,5 
Mồi xuôi 10 pmol/µl 1 
Mồi ngƣợc 10 pmol/µl 1 
DNA khuôn 10-100 ng/µl 1 
Taq-polymerase 5 unit/µl 0,5 
dNTPs 10nM 2,5 
MgCl2 25mM 2,5 
BSA 1X 1mg/ml 4 
Bổ sung H2O 10 
Chạy máy PCR với chu trình nhiệt sau: Biến tính DNA ở 94oC: 2 phút, 
thực hiện 30 chu kỳ phản ứng với chu trình nhiệt: 94oC - 45 giây, Tm 55oC - 45 
giây, 72
o
C - 1 phút; kéo dài ở 72oC - 8 phút để hoàn tất phản ứng; sau đó mẫu 
đƣợc giữ ở 4oC. 
3.2. Phƣơng pháp điện di 
Trong điện trƣờng theo chiều từ cực âm đến cực dƣơng, các DNA có kích thƣớc 
lớn hoặc mạch thẳng sẽ chuyển động chậm hơn các DNA dạng siêu xoắn hoặc kích 
thƣớc bé. Trong một phạm vi nhất định của nồng độ gel agarose, kích thƣớc phân tử tỉ lệ