Ảnh hưởng ph đến hoạt tính xúc tác của enzyme lipasecandida rugosa và porcine pacreas

ĐẶC SAN THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ < 1 
HOẠT ĐỘNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỊA PHƯƠNG <<
ẢNH HƯỞNG PH ĐẾN HOẠT TÍNH XÚC 
TÁC CỦA ENZYME LIPASECANDIDA 
RUGOSA VÀ PORCINE PACREAS
|| ThS. Tạ Thị Thanh Thúy
Trường Cao đẳng Kỹ thuật Công nghệ Bà Rịa - Vũng Tàu
I. PHẦN MỞ ĐẦU
Lipase là một trong những nhóm enzyme nổi bật 
với nhiều ứng dụng trong công nghiệp. Phản ứng 
thủy phân lipid dưới sự có mặt của enzyme lipase 
mang lại các hợp chất sinh học và hóa học hữu ích 
(các acid béo tự do, các glycerol có giá trị cao...), 
làm công cụ cho dẫn xuất dược phẩm, thực phẩm, 
mỹ phẩm, v.v... Phản ứng thủy phân và tổng hợp 
chất béo diễn ra theo sơ đồ sau:
Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình 
thủy phân chất béo dưới sự tác động của enzyme 
lipase nhằm có các yếu tố tối ưu để thực hiện quá 
trình phản ứng, thu được hiệu suất của phản ứng 
cao nhất. Từ đó thu được hợp chất mong muốn 
với khối lượng cao. pH là một trong những yếu tố 
hàng đầu ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình phản 
ứng thủy phân lipid với xúc tác enzyme lipase. pH 
cao hoặc thấp quá đều có thể làm mất hoạt tính 
xúc tác của lipase. Do đó việc xác định được pH 
tối ưu là hết sức quan trọng trong phản ứng thủy 
phân chất béo.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 
NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu
2.1.1. Chủng vi sinh vật
Tóm tắt: Trong những năm gần đây, lĩnh vực 
enzyme đã ngày càng thể hiện được thế mạnh 
cũng như khẳng định được tính chất ưu việt của nó 
trong nhiều ngành công nghiệp. Và lipase là nhóm 
enzyme được nghiên cứu cũng như được sử dụng 
nhiều nhất trong ngành công nghiệp, chúng xúc 
tác một số lượng lớn các phản ứng thủy phân và 
tổng hợp dẫn đến sự đa dạng các sản phẩm như 
các acid, các ester, các amide, v.v...
Bài báo này báo cáo kết quả nghiên cứu sự ảnh 
hưởng của pH đến hoạt tính xúc tác của 2 enzyme 
lipase (Candida rugosa và Porcine pancreas) trên cơ 
chất là dầu olive, xác định pH tối ưu của 2 enzyme, 
và độ bền pH của 2 loại enzyme này. Kết quả cho 
thấy lipase từ Candida rugosa hoạt động thủy phân 
tốt trong điều kiện nhiệt độ 40oC, pH 7.0 (hoạt tính 
đạt 1871 U/mg chế phẩm enzyme), tăng 58% so với 
hoạt tính ban đầu (1179 U/mg chế phẩm enzyme). 
Còn lipase từ Porcine pancreas thì hoạt động tốt 
trong điều kiện 40oC, pH 8.5 (hoạt tính đạt 171 U/
mg chế phẩm enzyme), tăng 28% so với hoạt tính 
ban đầu (134 U/mg chế phẩm enzyme).
Abstract: In recent years, enzyme has shown its 
strength and outstanding position in industries.
Lipases are the most studied enzymes and the most 
used in industries. They catalyse a great number of 
reactions, hydrolysis and synthesis, leading to a 
great diversity of acids, esters, amides ... 
The result showed that optimum conditions for 
the lipase from Candida rugosa were determined 
as the pH of 7.0 and 40oC. Under these conditions, 
activity of lipase was 1871 U/mg enzyme, increasing 
58% compared with the first activity (1179 U/mg 
enzyme). And for lipase from Porcine pancreas the 
optimum conditions were found at 40oC and the 
pH of 8.5. Under these conditions, activity of lipase 
was 171 U/mg enzyme, increasing 28% compared 
with the first activity of 134 U/mg enzyme
Từ khóa: Enzyme activity, lipase hydrolysis, 
Candida rugosa, Porcine pancreas
Hình 1. Phản ứng thủy phân và tổng hợp triacylglycerol có 
xúc tác của lipase.
>> HOẠT ĐỘNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỊA PHƯƠNG
2 > ĐẶC SAN THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
- Enzyme lipase Candida rugosa (LCR), Type 
VII ký hiệu L1754, do công ty Sigma-Aldrich 
cung cấp.
- Enzyme lipase Porcine pacreas (LPP), Type 
II, ký hiệu L3126 do công ty Sigma-Aldrich cung 
cấp. 
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất khác
* Dầu olive: được nhập khẩu từ Italia, sản phẩm 
được đóng chai tại Việt Nam bởi công ty TNHH 
Dầu Thực vật Cái Lân, Hiệp Phước, Thành phố 
Hồ Chí Minh. Sản xuất theo công nghệ chiết xuất 
lạnh.
* Hóa chất khác
- Gum Arabic, H
3
PO
4
 85%, NaOH, KOH, H
2
SO
4
, 
Etanol 99.5%, chất chỉ thị màu Phenoltalein, 
KH
2
PO
4
, Na
2
HPO
4
, AlCl
3
, CaCl
2
, MgCl
2
, và một 
số hóa chất khác (China). 
- Nước cất được sử dụng trong suốt quá trình 
làm thí nghiệm. 
2.2. Thiết bị
- Máy đo pH - Bể điều nhiệt
- Máy khuấy từ có gia nhiệt - Máy đồng hóa
- Tủ lạnh - Tủ sấy
Và một số thiết bị thông thường khác 
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Chuẩn bị nhũ tương dầu olive 
Thành phần gồm: 73 ml nước cất, 7 gam Gum 
Arabic, 93 ml dầu olive. Đầu tiên trộn đều Gum 
với nước cất sau đó cho dần dần dầu vào và thực 
hiện nhũ hóa 10 - 15 phút trong máy đồng hóa. 
Hỗn hợp sau đồng hóa được cho là đạt là khi để 
yên trong 1 thời gian không thấy hiện tượng bị 
phân lớp.
* Hoạt tính của enzyme (U/mg enzyme) được 
tính theo công thức sau:
Trong đó: 
a: Lượng NaOH chuẩn độ ở mẫu có enzyme (ml)
b: Lượng NaOH chuẩn độ ở mẫu trắng (ml)
m: Khối lượng enzyme (mg)
Hoạt tính riêng của enzyme. Được xác định 
thông qua hoạt tính tổng (U) và hàm lượng protein 
có trong mẫu thí nghiệm, tức là số đvht/mg protein 
enzyme.
2.3.2. Ảnh hưởng của pH
* Thông số khảo sát:
- Enzyme lipase Candida rugosa pH = 5.5 - 6.0 - 
6.5 - 7.0 - 7.5 - 8.0, sử dụng đệm Phosphat 
- Enzyme lipase Porcine pancreas pH = 6.5 - 7.0 
- 7.5 - 8.0 - 8.5 - 9.0, sử dụng đệm Borat 
* Thông số cố định:
- Dung dịch đệm: 6 ml (đệm Phosphat pH 7.2 
đối với LCR, đệm Borat pH 7.7 đối với LPP)
- Dung dịch enzyme: 1 ml (3.04 mg enzyme /ml 
với LPP, 0.32 mg enzyme/ml đối với LCR)
- Nhũ tương dầu olive: 3 ml
- Thời gian phản ứng: 1 giờ
- Nhiệt độ: 37oC
- Tốc độ khuấy: 250 rpm
Khi kết thúc phản ứng, để bất hoạt enzyme bổ 
sung thêm 3ml etanol 99.5%. Sau đó nhỏ 3 giọt 
phenoltalein 0.1% làm chất chỉ thị màu rồi chuẩn 
độ bằng NaOH 0.1M.
Hoạt tính của enzyme được tính theo công thức 
(1) ở mục 2.3.1.
2.3.3. Độ bền pH
Để khảo sát độ bền pH của 2 enzyme tiến hành 
như sau:
* Thông số thay đổi là:
 pH = 6.5 - 7.0 - 7.5 - 8.0 đối với LCR
 pH = 7.5 - 8.0 - 8.5 - 9.0 đối với LPP
* Thông số cố định:
- Dung dịch đệm: 6 ml 
- Dung dịch enzyme: 1 ml (3.04 mg enzyme/ml 
với LPP; 0.32 mg enzyme/ml đối với LCR)
- Nhũ tương dầu olive: 3 ml
- Nhiệt độ: 37oC
Với từng giá trị pH, đo hoạt tính của enzyme 
sau 30phút - 1h - 2h - 3h - 4h - 5h xảy ra phản 
ứng. Khi kết thúc phản ứng, để bất hoạt enzyme 
bổ sung thêm 3ml etanol 99.5%. Sau đó nhỏ 3 giọt 
phenoltalein 0.1% làm chất chỉ thị màu và chuẩn 
độ bằng NaOH 0.1M.
Hoạt tính của enzyme được tính theo công thức 
(1) ở mục 2.3.1.
* Xác định thời gian bán hủy t
1/2
Hệ số ức chế k
d
, và thời gian bán hủy t
1/2
 được 
tính theo công thức sau (Bailey et al., 1986; 
Bayramolu et al.,2003) [19]
[A] = [A
o
]. (2)
k 
d
: hệ số ức chế (1/phút)
ĐẶC SAN THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ < 3 
HOẠT ĐỘNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỊA PHƯƠNG <<
A
o
: hoạt tính ban đầu của enzyme (U/mg protein)
A: hoạt tính sau thời gian t của enzyme (U/mg 
protein)
Thời gian bán hủy được tính theo công thức:
t
1/2
 = 0.693/k
d 
(3)
Phương pháp xử lý số liệu 
Mỗi thí nghiệm trong nghiên cứu này được lặp 
lại ba lần. Kết quả trình bày là giá trị trung bình 
của ba lần lặp lại. Tất cả kết quả thí nghiệm được 
xử lí theo phương pháp phân tích ANOVA bằng 
phần mềm Statgraphic Centurion XV.I nhằm mục 
đích xem xét sự khác biệt giữa các mẫu phân tích 
có ý nghĩa về mặt thống kê hay không.
Phương pháp xử lý số liệu của phân tích 
ANOVA:
Phân tích phương sai ANOVA để xác định các 
mẫu phân tích có khác nhau có ý nghĩa hay không. 
Giả thuyết H
o
: sự khác nhau của các mẫu phân tích 
có ý nghĩa về mặt thống kê (chọn mức ý nghĩa là 
0.5%). Nếu P-value < 0.05 thì có sự khác biệt giữa 
các mẫu có ý nghĩa về mặt thống kê. Nếu P-value 
> 0.05 thì sự khác biệt giữa các mẫu không có ý 
nghĩa về mặt thống kê.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính hai 
enzyme
pH có ảnh hưởng khá lớn đến vận tốc phản ứng 
của enzyme, mỗi enzyme hoạt động mạnh trong 1 
dải pH khác nhau. Đối với lipase khoảng pH dao 
động khá rộng: như lipase từ dầu thầu dầu thì pH 
là 4.7 [3], còn lipase từ tuyến tụy của động vật pH 
có thể lên đến 9.0. Như vậy tùy thuộc vào nguồn 
gốc mà mỗi lipase sẽ có một giá trị pH tối ưu khác 
nhau. Ở giá trị pH mà tại đó enzyme hoạt động 
mạnh nhất gọi là pH tối ưu. Tiến hành xác định 
hoạt độ lipase của LCR và LPP với các giá trị pH 
thay đổi, với cùng cơ chất nhũ tương dầu olive, ở 
nhiệt độ 37°C. Sử dụng đệm phosphat cho LCR, 
đệm borat cho LPP. Kết quả thí nghiệm được thể 
hiện ở bảng 1 và biểu diễn trên hình 2.
Với LCR và LPP lấy hoạt tính tại giá trị pH cho 
hoạt tính cao nhất làm đối chứng
Qua bảng 1 và hình 2 cho thấy hoạt tính LCR 
mạnh nhất ở pH 7.0 (1572.3 U/mg enzyme, tương 
Bảng 1. Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính của 
hai enzyme lipase
Lipase từ Candida rugosa Lipase từ Porcine Pancreas
pH Hoạt tính(U/mg enzyme)
Hoạt 
tính
%
pH Hoạt tính(U/mg enzyme)
Hoạt 
tính
%
5.5 1157.2 ± 80.26b 73.6 6.5 41.1 ± 0.85e 17
6.0 1462.3 ± 16.76cd 93 7.0 98.5 ± 1.69f 41
6.5 1478.0 ± 10.61cd 94 7.5 111.8 ± 2.33g 47
7.0 1572.3 ± 39.38d 100 8.0 131.6 ± 7.21h 55
7.5 1415.1 ± 20.93c 90 8.5 240.1 ± 7.28k 100
8.0 864.78 ± 62.65a 55 9.0 108.5 ± 4.17fg 45
Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị được đánh dấu 
bởi những chữ cái giống nhau thì khác nhau không có ý nghĩa 
theo phân tích thống kê ANOVA (α = 0.05).
Hình 2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính LPP và LCR 
ứng 100% hoạt tính) khi tăng pH lên 8.0 hoạt 
tính LCR giảm đi chỉ còn một nửa (864.78 U/mg 
enzyme) còn khi giảm pH thì hoạt tính enzyme có 
giảm chậm dần (xem kết quả ở bảng 1), điều này 
cho thấy LCR hoạt động được ở dải pH rộng từ 
pH 5.5 đến pH 7.5, pH tối ưu là 7.0. Ở các giá 
trị pH không phải là tối ưu, hoạt tính dao động 
từ 73% đến 94% hoạt tính tối đa. Kết quả nghiên 
cứu này cũng giống như kết quả của tác giả Banu 
ÖZTÜRK (2001), theo đó tác giả cũng kết luận 
lipase từ Candida rugosa hoạt động khá ổn định 
trong khoảng pH 6.0 đến 7.0. Và theo Fadõloğlu 
and Söylemez (1997) cũng cho kết quả rằng pH 
tối ưu của lipase từ Candida rugosa là 7.0. Ngoài 
ra, kết quả của tôi cũng gần tương tự như nhóm tác 
giả Montero và cộng sự (1993), họ kết luận rằng 
lipase tự do từ Candida rugosa ổn định hoạt tính 
trong khoảng 6.2 đến 7.7 và khi tăng pH lên 8.0 thì 
>> HOẠT ĐỘNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỊA PHƯƠNG
4 > ĐẶC SAN THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
lipase bị mất hoạt tính một cách đáng kể.
Còn đối với LPP thì hoạt tính tốt nhất ở pH 8.5 
(hoạt tính đạt 240.1 U/mg enzyme, tương ứng 
100%). Tuy nhiên so với hoạt tính tối đa của LCR 
thì hoạt tính của LPP thấp hơn nhiều lần. Khi 
tăng lên pH 9.0 hoặc giảm pH 7.5 thì hoạt tính 
giảm chỉ còn 45 - 55%, tiếp tục giảm thì hoạt tính 
LPP giảm rất nhanh (pH 6.5 chỉ còn 41.1 U/mg 
enzyme, tương ứng 17% hoạt tính còn lại). Điều 
này cho thấy LPP có dải pH hoạt động hẹp hơn so 
với LCR và LPP là một lipase ưa kiềm, đặc tính 
này cho thấy đây là một loại enzyme rất thích hợp 
cho ngành công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa 
hoạt động ở một môi trường có tính kiềm cao. Kết 
quả của chúng tôi khá tương đồng với nhóm tác 
giả K. Bagi, L. M. Simon (1996) cho rằng pH tối 
ưu cửa LPP là 8.9 [4]. Như vậy, chúng tôi kết luận 
LCR hoạt động trong môi trường trung tính và hơi 
acid còn LPP hoạt động trong môi trường kiềm. 
Từ các kết quả trên chúng tôi chọn pH 7.0 đối 
với LCR, và pH 8.5 đối với LPP để tiếp tục tiến 
hành các thí nghiệm về sau.
3.2. Ảnh hưởng của pH tới tính bền của hai 
enzyme 
Cấu trúc bậc ba của một protein phụ thuộc vào 
liên kết hydro giữa các nhóm R, chỉ cần một sự 
thay đổi nhỏ pH cũng có thể thay đổi khả năng 
ion hóa của các chuỗi mạch bên và phá vỡ các cấu 
trúc tự nhiên, trong một số trường hợp có thể làm 
biến tính enzyme. Do đó mỗi enzyme đều có một 
khoảng pH tối ưu để giúp duy trì cấu trúc tự nhiên 
của nó trong môi trường mà nó hoạt động.
Để xác định tính chất của lipase khi thủy phân 
cơ chất, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tính bền 
của hai enzyme này trong quá trình thực hiện thủy 
phân dầu olive. Khảo sát tính bền của LCR trong 
các giá trị pH từ 6.5 đến 8.0 sử dụng đệm phosphat, 
còn LPP thì các giá trị pH từ 7.5 đến 9.0 với đệm 
borat. Với mỗi giá trị pH sau những khoảng thời 
gian xác định (30 phút - 1h - 2h - 3h - 4h - 5h) của 
quá trình thủy phân thì tiến hành đo lượng cơ chất 
tạo thành, xác định hoạt tính tại từng thời điểm đó, 
xác định giá trị k
d
, và tính t
1/2
 như công thức (2) và 
(3) trong phần 2.3.3 đã giới thiệu. Kết quả được 
trình bày trong bảng 2 và bảng 3 như sau:
Bảng 2. Thời gian bán hủy và hệ số ức chế của LPP 
tại các pH khác nhau
pH
Lipase từ Porcine pancreas
t1/2 (min) kd (min
-1)
7.5
8.0
8.5
9.0
165
154
148
408
4.2.10-3
4.5.10-3
4.7.10-3
1.7.10-3
Bảng 3. Thời gian bán hủy và hệ số ức chế của LCR 
tại các pH khác nhau
pH Lipase từ Candida rugosa
t1/2 (min) kd (min
-1)
6.5
7.0
7.5
8.0
217
210
169
151
3.2.10-3
3.3.10-3
4.1.10-3
4.6.10-3
Hình 3. Độ bền pH theo thời gian của LPP
Hình 4. Độ bền pH theo thời gian của LCR
Qua kết quả ở bảng và hình cho thấy đối với 
LCR tại pH 6.5, thời gian bán hủy là 217 phút (3,6 
giờ) tương ứng với hoạt tính còn lại 50% sau 3,6 
giờ thủy phân. Tại pH 7.0, thời gian bán hủy cũng 
gần với tại pH 6.5 (3,5 giờ), khi pH tăng lên 8.0, 
ĐẶC SAN THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ < 5 
HOẠT ĐỘNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỊA PHƯƠNG <<
thời gian bán hủy còn 151 phút (2,5 giờ), giảm 
hơn 1 giờ so với khi ở môi trường pH trung tính 
và acid. Như vậy ở khoảng pH 6.5 đến 7.5, LCR 
hoạt động đều và thời gian bán hủy là hơn 2.5 giờ, 
tuy nhiên LCR thể hiện rõ hoạt động bền trong 
vùng pH trung tính và hơi acid (pH 7.0 và pH 6.5), 
lúc này t
1/2
 là 3,5 giờ. Kết quả này cũng tương tự 
với Montero et al (1993), tác giả này xác định 
khoảng pH bền của LCR là 6.2 đến 7.7, và Banu 
ÖZTÜRK (2001) [5] thì cũng cho rằng LCR bền 
trong khoảng 6.0 đến 7.0.
Đối với LPP tại giá trị tối ưu pH 8.5 thời gian 
bán hủy là 148 phút (2,5 giờ) thấp hơn 1 giờ so với 
LCR cũng tại giá trị tối ưu, khi pH giảm đến 7.5 
thời gian bán hủy lại dài hơn 165 phút (2,8 giờ), 
khi pH tăng đến 9.0 lúc này thời gian bán hủy là 
6,8 giờ. 
Giá trị t
1/2
 và hệ số ức chế k
d
 cho 2 lipase thể hiện 
ở bảng 2 và bảng 3 cho thấy khi pH tăng giá trị k 
tăng và lúc này thời gian bán hủy (t
1/2
) lại giảm. 
Như vậy kết quả cho thấy LCR bền với pH hơn 
LPP, và LCR thì hoạt động tốt và bền ở vùng trung 
tính và hơi acid còn LPP thì môi trường hoạt động 
tốt là kiềm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
[1]. Hà Duyên Tư, 2009. Phân tích hóa học thực phẩm, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật.
[2]. PGS.TS Đặng Thị Thu, 2004. Nghiên cứu công nghệ sản xuất một số loại dầu béo bằng lipase. Bộ Khoa học 
và Công nghệ, Viện Công nghệ Thực phẩm, Hà Nội.
[3]. M. S. Rahman, a M.Y. Ali, b M.U. Alib and AJM Moynul Hasan, 2006. Studies on the Lipid and Glyceride 
Compositions of Cassia alata Seed Oil Bangladesh J. Sci. Ind. Res. 41 (1-2), 83-88.
[4]. K.Bagi, L.M.Simon, and B. SzajPni, 1997. Immobilization and characterization of porcine pancreas lipase. 
Elsevier science Inc.Enzyme and Microbial Technology 20:531-535.
[5]. Ghosh, R. K. Saxena, Rani Gupta, R. P. Yadav và Sheba Davidson. 1996. Microbial lipases: Production and 
applications. Science Progress, 79(2), 119-157.
IV. KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu khảo sát, tôi đã thu được một số 
kết luận về sự ảnh hưởng của pH lên 2 loại enzyme 
có nguồn gốc khác nhau như sau:
- Enzyme Porcine Pancreas L3126: có pH tối 
thích là 8.5, bền ở pH từ 7.5-8.5, sau 2h45 phút 
hoạt tính còn 50%
- Enzyme Candida rugosa L1754: có pH tối 
thích là 7.0, bền ở pH từ 6.5-7.0, sau 3h37 phút 
hoạt tính còn 50% 
Đây là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo: 
tiếp tục nghiên cứu các yếu tố khác ảnh hưởng 
đến quá trình thủy phân 2 loại enzyme trên, sau 
đó có thể thử nghiệm cố định lipase từ 1 trong 2 
enzyme trên vào trong chất mang (ví dụ như vật 
liệu Hydrotacite) để nâng cao tính chất cũng như 
hiệu suất sử dụng của enzyme. Ứng dụng 2 loại 
lipase trên để thủy phân các loại dầu béo khác từ 
thực vật và động vật.
T.T.T.T