Định lượng đồng thời vitamin B1, B6, B12 trong sữa bột và sữa tươi dielac grow plus, dielac alpha gold bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học - Tập 25, Số 1/2020 
ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI VITAMIN B1, B6, B12 TRONG SỮA BỘT 
VÀ SỮA TƯƠI DIELAC GROW PLUS, DIELAC ALPHA GOLD 
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 
Đến tòa soạn 3-12-2019 
Mai Xuân Trường, Nguyễn Gia Huy 
Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên 
SUMMARRY 
SIMULTANEOUS DETERMINATION OF VITAMINE B1, B6, B12 IN MILK 
AND FRESH MILK DIELAC GROW PLUS, DIELAC ALPHA GOLD 
BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY METHOD 
In this paper we announce the survey results of the optimum conditions to simultaneous determination 
of vitamine B1, vitamine B6 and vitamine B12 by high performance liquid chromatography (HPLC) 
method and simultaneously quantify vitamine B1, vitamine B6 and vitamine B12 in milk and fresh milk 
DIELAC GROW PLUS, DIELAC ALPHA GOLD by HPLC method. The results showed that the error 
when determining vitamine B1, vitamine B6 and vitamine B12 are less than 3% with the recovery of 
vitamine B1 from 91.35% to 100.81%; of vitamine B6 from 90.446% to 99.12%, of vitamine B12 from 
92.38% to 100.68%. 
1. MỞ ĐẦU 
Vitamin B1, B6, B12 có tác dụng hỗ trợ quá 
trình sản xuất năng lượng trong cơ thể cũng 
như trao đổi chất và chuyển hóa năng lượng 
trong tế bào. Vitamin B1, B6, B12 là thành 
phần chính trong các loại sữa bột hay sữa tươi. 
Việc xác định chính xác hàm lượng vitamin 
B1, B6 và B12 được bổ sung rất có ý nghĩa 
trong việc đảm bảo quyền lợi và sức khỏe của 
người tiêu dùng. Có rất nhiều phương pháp 
phân tích đã được nghiên cứu và áp dụng để 
xác định hàm lượng vitamin B1, B6, B12 trong 
thực phẩm như phương pháp điện hóa, phương 
pháp động học huỳnh quang, phương pháp sắc 
ký lỏng hiệu năng cao [1, 2]. Trong bài báo 
này, chúng tôi thông báo kết quả xác định đồng 
thời các vitamin B1, B6, B12 trong sữa bột và 
sữa tươi DIELAC GROW PLUS và DIELAC 
ALPHA GOLD bằng phương pháp sắc ký lỏng 
hiệu năng cao. 
2. THỰC NGHIỆM 
2.1. Thiết bị và hóa chất 
Thiết bị 
Máy máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC - 
Acquity Arc (Mỹ) kết nối máy tính, Detector 
DPA, cột C18 (đường kính hạt pha tĩnh là 5 
μm, chiều dài cột tách 250 mm và đường kính 
cột 6,1 mm); máy rung siêu âm; Cân phân tích 
Scientech SA 210 độ chính xác 0,0001g; Máy 
đo pH và các dụng cụ pha chế khác. 
Hóa chất 
Na2HPO4, H3PO4, axetonitril, vitamin B1 
chuẩn (độ tinh khiết > 97,5%), vitamin B6 
chuẩn (độ tinh khiết > 98,8%), vitamin B12 
chuẩn (độ tinh khiết > 98,5%) của Merk. 
Sữa bột và sữa tươi do công ty Vinamilk sản 
xuất: Sữa bột DIELAC GROW PLUS số lô: 
E7, ngày sản xuất: 26/02/2019, hạn sử dụng: 
26/02/2021; Sữa bột DIELAC ALPHA GOLD 
số lô: R3, ngày sản xuất: 26/02/2019, hạn sử 
204
dụng: 26/02/2021; Sữa tươi DIELAC GROW 
PLUS số lô: 0E72GPG15, ngày sản xuất: 
28/6/2019, hạn sử dụng: 27/12/2019; Sữa tươi 
DIELAC ALPHA GOLD số lô: 0D72GPG03, 
ngày sản xuất: 28/6/2019, hạn sử dụng: 
27/12/2019. 
Dung môi pha mẫu: dung dịch đệm photphat 
(pH=3): dung dịch axetonitril tỉ lệ 80:20 về thể 
tích. 
2.2. Quy trình phân tích 
- Pha các dung dịch chuẩn vitamin B1, vitamin 
B6 và vitamin B12. 
- Khảo sát các điều kiện tối ưu của phương 
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để xác 
định đồng thời vitamin B1, B6, B12. 
- Xác định đồng thời vitamin B1, B6, B12 
trong sữa bột và sữa tươi DIELAC GROW 
PLUS và DIELAC ALPHA GOLD. 
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
Tiến hành khảo sát cho thấy các điều kiện tối 
ưu cho phép đo là: Detector DPA bước sóng 
chọn lọc đối với vitamin: B1 (246 nm); vitamin 
B6 (291 nm) và vitamin B12 (361 nm); Tốc độ 
dòng chảy: 1,0 mL/phút; Pha động: kênh A: 
dung dịch đệm photphat (pH=3) + kênh B: 
dung dịch axetonitril tỉ lệ 80:20 về thể tích. 
Tiến hành quét phổ hấp thụ của dung dịch chứa 
các vitamin riêng rẽ B1, B6 và B12 từ bước 
sóng 200 nm đến 400 nm. Các điều kiện khác 
cố định không đổi gồm kênh A là dung dịch 
đệm photphat, kênh B là axetonitril với tỉ lệ 
80:20 về thể tích, tốc độ dòng là 1 mL/phút. 
Phổ hấp thụ của viatmin B1, B6 và B12 thu 
được ở hình 1, 2, 3; Sắc ký đồ của hỗn hợp 3 
vitamin B1, B6 và B12 ở hình 4. 
Hình 1. Phổ hấp thụ của vitamin B1 
Hình 2. Phổ hấp thụ của vitamin B6 
Hình 3. Phổ hấp thụ của vitamin B12 
Hình 4. Sắc ký đồ của vitamin B1, B6 và B12 
Khảo sát khoảng tuyến tính của vitamin B1, 
B16 và B12 trong khoảng nồng độ từ 0,4 
(ppm)-2,8 (ppm) trong điều kiện sắc ký đã 
chọn ở trên. Xác định được sự phụ thuộc tuyến 
tính giữa nồng độ và diện tích pic bằng phương 
trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan 
R2. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin 
B1, B16 và B12 được trình bày ở bảng 1. 
205
Bảng 1. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B1, B6 và B12 
Vitamin B1 Vitamin B6 Vitamin B12 
Nồng độ 
(ppm) 
Diện tích pic 
(mAuxphút) 
Nồng độ 
(ppm) 
Diện tích pic 
(mAuxphút) 
Nồng độ 
(ppm) 
Diện tích pic 
(mAuxphút) 
0,4 69936 0,4 58998 0,4 9312 
0,8 95585 0,8 80251 0,8 31498 
1,2 117234 1,2 105503 1,2 56114 
1,4 129059 1,4 117129 1,4 67932 
1,6 140884 1,6 129755 1,6 76829 
2,2 176358 2,2 162364 2,2 116153 
2,8 211831 2,6 198512 2,8 149576 
y = 58779x+47083 y = 58276x + 35206 y = 58860x - 14962 
R2 = 0,9998 R2 = 0,9996 R2 = 0,9993 
Để xác định đồng thời các vitamin B1, B6 và 
B12 trong sữa bột DIELAC GROW PLUS và 
DIELAC ALPHA GOLD tiến hành như sau: 
Cân chính xác 5,0000 gam sữa bột (hoặc hút 
chính xác 15,0 mL sữa tươi) cho vào ống nhựa 
ly tâm (50mL), hòa tan thành 25 mL bằng 
dung môi pha mẫu. Lắc đều, rung siêu âm, sau 
đó ly tâm gạn lấy dung dịch sau đó đem lọc 
qua giấy lọc và màng lọc có kích thước 0,45 
μm trước khi bơm vào hệ thống HPLC. Kết 
quả phân tích của 4 lần lặp lại thu được kết quả 
ở bảng 2. 
Bảng 2. Kết quả xác định vitamin B1, B6, B12 trong sữa Dielac Grow Plus và Dielac Alpha Gold 
Mẫu 
Dielac Grow Plus Dielac Alpha Gold 
HLLT HLXĐ %RSD HLLT HLXĐ %RSD 
Sữa bột Dielac Grow Plus và Dielac Alpha Gold 
Vitamin B1 2,200 2,247 1,25% 1,260 1,266 1,03% 
Vitamin B6 2,200 2,252 1,47% 1,500 1,537 0,79% 
Vitamin B12 0,004 - - 0,003 - - 
Sữa tươi Dielac Grow Plus và Dielac Alpha Gold 
Vitamin B1 0,468 0,478 2,09% 0,668 0,677 2,07% 
Vitamin B6 0,668 0,666 2,10% 1,200 1,256 2,31% 
Vitamin B12 0,004 - - 0,004 - - 
Trong đó: 
HLLT: là hàm lượng lý thuyết của vitamin B1, 
B6 và B12 trong sữa bột và sữa tươi DIELAC 
GROW PLUS và DIELAC ALPHA GOLD do 
nhà sản xuất công bố (ppm) 
HLXĐ: làm hàm lượng của vitamin B1, B6 và 
B12 trong sữa bột DIELAC GROW PLUS và 
DIELAC ALPHA GOLD xác định được 
(ppm). 
%RSD là độ lệch chuẩn tương đối của phép 
xác định. 
Nhận xét: Kết quả xác định vitamin B1, B6 và 
B12 ở bảng 2 cho thấy hàm lượng vitamin B1, 
B6 trong sữa bột và sữa tươi DIELAC GROW 
PLUS và DIELAC ALPHA GOLD do nhà sản 
xuất công bố và hàm lượng vitamin B1, B6 xác 
định được khác nhau không đáng kể. Kết quả 
trên cho thấy độ lệch chuẩn tương đối (%RSD) 
của vitamin B1 và B6 trong sữa bột và sữa tươi 
đều nhỏ hơn 2,31% . Riêng với vitamin B12 
trong sữa có hàm lượng rất nhỏ dưới giới hạn 
206
phát hiện của phương pháp do đó chúng tôi sử 
dụng phương pháp thêm chuẩn để xác định. 
Cân chính xác 5,0000 gam sữa bột (hoặc hút 
chính xác 15,0 mL sữa tươi) cho vào ống nhựa 
ly tâm (50mL); thêm lượng chất chuẩn vitamin 
B1 (hoặc vitamin B6 hoặc vitamin B12 như 
bảng 3), hòa tan thành 25 mL bằng dung môi 
pha mẫu. Lắc đều, rung siêu âm, sau đó ly tâm 
gạn lấy dung dịch sau đó đem lọc qua giấy lọc 
và màng lọc có kích thước 0,45 μm trước khi 
bơm vào hệ thống HPLC. 
Bảng 3. Nồng độ vitamin B1, B6 và B12 chuẩn thêm vàosữa bột và sữa tươi 
DIELAC GROW PLUS và DIELAC ALPHA GOLD 
Mẫu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 
Nồng 
độ 
thêm 
chuẩn 
B1 0,800 1,600 2,000 2,800 - - - - - - - - 
B6 - - - - 0,800 1,600 2,000 2,800 - - - - 
B12 - - - - - - - - 0,800 1,600 2,000 2,800 
Tiến hành chạy sắc ký các mẫu thêm chuẩn ở 
điều kiện sắc ký đã chọn ở trên. Kết quả phân 
tích của 4 lần lặp lại thu được kết quả ở bảng 4. 
Nhận xét: Kết quả xác định vitamin B1, B6 và 
B12 theo phương pháp thêm chuẩn ở bảng 4 
cho thấy hàm lượng thêm chuẩn các vitamin 
B1, B6 và B12 và hàm lượng xác định được 
tương đối phù hợp, độ thu hồi của vitamin B1 
từ 91,35% đến 100,81%, của vitamin B6 từ 
90,44% đến 99,12% và của vitamin B12 từ 
92,38% đến 100,68%. Điều đó chứng tỏ 
phương pháp nghiên cứu có đủ tin cậy để phân 
tích sữa bột và sữa tươi DIELAC GROW 
PLUS và DIELAC ALPHA GOLD trong thực 
tế. 
Bảng 4. Kết quả xác định độ thu hồi - Rev (%) của vitamin B1, B6 và B12 trong sữa bột và sữa tươi 
DIELAC GROW PLUS và DIELAC ALPHA GOLD theo phương pháp thêm chuẩn 
Mẫu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 
Sữa bột 
Dielac 
Grow 
Plus 
B1 91,35 92,86 99,77 100,81 - - - - - - - - 
B6 - - - - 96,54 97,81 93,22 91,17 - - - - 
B12 - - - - - - - - 97,38 98,25 92,85 93,21 
Sữa bột 
Dielac 
Alpha 
Gold 
B1 92,50 98,75 93,50 92,14 - - - - - - - - 
B6 - - - - 98,82 98,36 99,12 98,74 - - - - 
B12 - - - - - - - - 97,75 98,06 92,75 96,50 
Sữa tươi
Dielac 
Grow 
Plus 
B1 98,52 95,65 95,14 92,75 - - - - - - - - 
B6 - - - - 96,31 94,27 92,72 91,56 - - - - 
B12 - - - - - - - - 92,38 98,94 97,05 94,64 
Sữa tươi
Dielac 
Alpha 
Gold 
B1 97,25 91,54 98,65 93,18 - - - - - - - - 
B6 - - - - 97,71 98,38 91,22 90,44 - - - - 
B12 - - - - - - - - 98,75 95,94 96,30 100,68 
207
4. KẾT LUẬN 
Đã khảo sát và lựa chọn được điều kiện tối ưu 
cho phép xác định vitamin B1, B6 và B12 bằng 
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao; Các 
kết quả xác định đồng thời vitamin B1, B6 và 
B12 trong sữa bột và sữa tươi DIELAC 
GROW PLUS và DIELAC ALPHA GOLD có 
sai số đối với vitamin B1 (<2,09%), độ thu hồi 
từ 91,35% đến 100,81%; sai số của phép xác 
định vitamin B6 (<2,31%) và độ thu hồi từ 
90,44% đến 99,12%; vitamin B12 có độ thu 
hồi từ 92,38% đến 100,68%. Các kết quả xác 
định cho thấy hàm lượng vitamin B1, B6 và 
B12 trong sữa bột và sữa tươi DIELAC 
GROW PLUS và DIELAC ALPHA GOLD 
đáp ứng các tiêu chuẩn dược dụng Việt Nam 
[3, 4, 5]. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
[1]. Nguyễn Phi Hải (2016), Nghiên cứu xây 
dựng quy trình định lượng 3 hoạt chất vitamin 
B1, B6, B12 trong sản phẩm thuốc tiêm đông 
khô Neutrivit 5000 bằng phương pháp sắc ký 
lỏng hiệu năng cao (HPLC), Luận văn thạc sỹ 
kỹ thuật hóa học, Trường Đại học Bách khoa 
Hà Nội. 
[2]. C. K. Markopoulou, K. A. Kagkadis, J. E. 
Koundourelli (2002), An optimized method for 
the simultaneous determination of vitamins B1, 
B6, B12 in multivitamin tablets by 
highperformance liquid chromatography, 
Journal of Pharmaceutical and Biomedical 
Analysis. 
[3]. TCVN 5164:2008 (EN 14122:2003) Tiêu 
chuẩn xác định Vitamin B1 bằng sắc ký lỏng 
hiệu năng cao (HPLC). 
[4]. TCVN 9513:2012 (EN 14663:2005) Tiêu 
chuẩn xác định vitamin B6 bằng phương pháp 
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 
[5]. TCVN 9514:2012 Tiêu chuẩn xác định 
vitamin B12 bằng phương pháp sắc ký lỏng 
hiệu năng cao (HPLC). 
208